發(fā)布時間：2020-09-24 07:32

　　 結直腸癌(Colorectalcancer,CRC)是臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近些年來,隨著人們生活水平不斷提高和飲食習慣發(fā)生改變,結直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢,嚴重威脅著人類健康。盡管以手術為主、放化療為輔的傳統(tǒng)治療模式有了很大改進,但晚期結腸癌的治療仍不滿意,患者總體生存率并無顯著提高。因此,尋找行之有效的其他療法配合甚至取代手術治療,對降低結直腸癌的復發(fā)率和病死率,提高其治愈率和改善患者的生活質量具有重要性。細胞自噬是一種細胞內(nèi)自我降解的方式,是將細胞內(nèi)受損、變形、衰老或失去功能的蛋白質以及細胞器運輸?shù)饺苊阁w,并進行消化和降解的過程。這一過程對細胞穩(wěn)態(tài)維持是必需的,也是細胞抵御病原體的保護機制。細胞自噬與腫瘤的關系非常復雜,目前認為在腫瘤發(fā)生時細胞自噬起到抑制作用,但在腫瘤發(fā)展的進程中,細胞自噬又可能為腫瘤細胞提供對抗營養(yǎng)缺乏和缺氧的機制,促進腫瘤細胞的生存。細胞自噬是許多腫瘤抵御化療藥物的機制,但在某些情況下,細胞自噬在腫瘤細胞的抗癌藥物介導的細胞死亡中發(fā)揮著促進細胞死亡的作用,促進細胞自噬性死亡卻又是某些腫瘤治療的有效手段。隨著自噬研究現(xiàn)象的深入,自噬逐漸成為一個新的癌癥治療靶點。首先在人結腸癌細胞HT29中分別轉染RIP3 shRNA干擾質粒和過表達質粒,用無糖培養(yǎng)液誘導細胞自噬,發(fā)現(xiàn)敲低RIP3后細胞自噬減弱,而過表達RIP3后細胞自噬增強。我們首次發(fā)現(xiàn):RIP3能夠促進人結腸癌細胞HT29的細胞自噬。接著,對RIP3調(diào)控人結腸癌細胞自噬的可能分子機制展開進一步的深入研究。首先,WesternBlotting結果顯示葡萄糖饑餓誘導的HT29細胞自噬并不依賴于經(jīng)典的mTOR信號途徑。通過質譜研究發(fā)現(xiàn),RIP3與結腸癌中可能參與細胞自噬的G蛋白GNAI3和G蛋白調(diào)節(jié)因子RGS19相互作用,用免疫共沉淀方法進一步驗證了這一結果。我們推測RIP3可能通過與GNAI3和RGS19的相互作用介導了結腸癌的細胞自噬。盡管,RIP3敲低或過表達后,GNAI3和RGS19的表達量不發(fā)生改變,但是,研究結果發(fā)現(xiàn)GNAI3或RGS19的表達下調(diào)會抑制HT29細胞自噬,并且GNAI3的GTPase酶活性能夠促進HT29細胞自噬。RIP3是一個絲氨酸/蘇氨酸激酶,我們推測RIP3可能通過其激酶活性而影響了細胞自噬,通過將激酶活性點突變的RIP3表達質�；匮a到RIP3敲低的細胞中,誘導細胞自噬后發(fā)現(xiàn)RIP3的激酶活性確實能夠促進HT29細胞自噬,且其發(fā)揮作用的激酶活性中心為K50。體外激酶活性分析實驗表明RIP3激酶能夠分別磷酸化GNAI3和RGS19。因此,我們猜測RIP3激酶可能通過磷酸化GNAI3和RGS19而影響了葡萄糖饑餓誘導的HT29細胞自噬。應用免疫共沉淀結合質譜分析篩選出一些可能的磷酸化位點,GNAI3可能被RIP3激酶磷酸化的位點有:S6和S164;RGS19可能被RIP3激酶磷酸化的位點有:T12、S199、S213和S214。此外,為了尋找葡萄糖饑餓誘導的HT29細胞自噬中,RIP3可能的上下游蛋白,除了GNAI3和RGS19,應用免疫共沉淀結合質譜分析還篩選出了 ACAA1和DDX24兩個蛋白。有研究報道ACAA1和DDX24與腫瘤的發(fā)生有密切關系,但是其是否參與細胞自噬,目前沒有相關報道。這有待于我們后續(xù)的進一步深入研究。為了考查RIP3調(diào)控的細胞自噬在人結腸癌發(fā)生發(fā)展和治療中的影響,我們應用細胞生長曲線、細胞集落形成實驗、MTT法檢測耐藥性和裸鼠皮下移植瘤實驗檢測RIP3調(diào)控的細胞自噬對人結腸癌細胞的影響。研究結果顯示敲低RIP3后,HT29細胞生長增快,集落形成能力增強,誘導細胞自噬后的細胞增殖抑制率降低,裸鼠皮下移植瘤體積增大;而過表達RIP3后,HT29細胞生長減慢,集落形成能力減弱,裸鼠皮下移植瘤體積減小。敲低RIP3后,加入無糖培養(yǎng)液誘導,HT29細胞的增殖抑制率降低,說明RIP3的低表達可以通過降低細胞自噬水平而提高其存活率;而加入化療藥物5-FU后,HT29細胞的增殖抑制率升高,說明RIP3的低表達可能通過降低了細胞的自噬水平從而增加了 HT29對化療藥物5-FU的敏感性,因此,認為HT29細胞對化療藥物5-FU的耐藥性可以通過降低細胞自噬水平而得到減輕。體內(nèi)外實驗結果一致,表明RIP3能夠通過促進細胞自噬而抑制結腸癌細胞HT29的生長,提示RIP3調(diào)控的細胞自噬參與了結腸癌的發(fā)生發(fā)展,其研究結果可為進一步了解結腸癌的發(fā)生發(fā)展機制和結腸癌的臨床治療提供潛在的應用價值。
【學位單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.35
【部分圖文】：

圖１細胞自噬信號通路圖逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ａｕｔｏｐｈａｇｙ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑越來越多的研究表明，細胞自噬與腫瘤發(fā)生、進展及對抗腫瘤治療的反應中逡逑有著直接或間接的聯(lián)系。細胞自噬與腫瘤的關系非常復雜，且仍部分存在爭議，逡逑目前認為在腫瘤發(fā)生時細胞自噬起到抑制作用，但在腫瘤發(fā)展的進程中，細胞自逡逑噬又可能為腫瘤細胞提供對抗營養(yǎng)缺乏和缺氧的機制，促進腫瘤細胞的存活［２８］。逡逑細胞自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著“雙刃劍”的作用，不能簡單將其劃分逡逑為“有害”或“有益”的，研究表明自噬對于腫瘤的影響是分階段和有針對性的。逡逑細胞自噬缺陷，生物體某些自發(fā)性腫瘤的發(fā)生幾率增高。當腫瘤發(fā)生后，自噬作逡逑用又可能為生活環(huán)境惡劣的腫瘤細胞提供有效的供養(yǎng)途徑。此外，細胞自噬在腫逡逑瘤細胞的抗癌藥物介導的細胞死亡中發(fā)揮不同作用，在不同腫瘤細胞和不同情況逡逑下細胞自噬可能會促進細胞死亡，也可能保護細胞使細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥作逡逑

用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法檢測ＲＩＰ３的表達水平。結果顯示，與對照組相比，逡逑ＲＩＰ３邋ｓｈＲＮＡ組的ＲＩＰ３表達量明顯降低，而Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３組的ＲＩＰ３表達量明顯升逡逑高（圖３．１Ａ），差異有統(tǒng)計學意義（ＰＣ０．０１或Ｐ＜０．００１），成功構建出ＲＩＰ３穩(wěn)逡逑定低表達和高表達的ＨＴ２９突變細胞株。采用無糖培養(yǎng)液誘導細胞自噬，１８小逡逑時后收集細胞提取總蛋白，用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法檢測細胞自嗤流情況。結果逡逑顯示，與對照組相比，敲低ＲＩＰ３后，細胞自噬流降低；而過表達ＲＩＰ３后，細逡逑胞自噬流升高；并且在沒有誘導細胞自噬的情況下，ＲＩＰ３低表達細胞的基礎白逡逑噬水平降低，ＲＩＰ３過表達細胞的基礎自噬水平升高（圖３．１Ｂ），差異有統(tǒng)計學逡逑意義（Ｐ＜０．０１）。因此，我們初步明確ＲＩＰ３參與了葡萄糖饑餓誘導的ＨＴ２９細逡逑胞自噬，并且能夠促進細胞自噬。逡逑邐ＨＴ２９邐邋ＨＴ２９－ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ邋ＨＴ２９－ｓｈＲｎ）３邋ＨＴ２９－Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３逡逑Ｖｅｃｔｏｒ邋＋邐＇邐＇邐＊邐Ｃｏｍｐｌｅｔｅ邋Ｍｅｄｉｕｍ邋＋＋－－邋＋邋＋邋－邋？邋＋邋＋邋．－逡逑Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３邐＋逡逑Ｃ0？

養(yǎng)液誘導ＨＴ２９－Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３細胞自嗤，采用免疫共沉淀的方法檢測ＲＩＰ３是否與內(nèi)逡逑源性的ＧＮＡＩ３和ＲＧＳ１９相互作用。結果顯示，隨著細胞自噬的增強，ＲＩＰ３與逡逑ＧＮＡＩ３的作用增強，與ＲＧＳ１９也有相互作用（圖３．３Ｂ），與前期質譜結果相符。逡逑Ｆｌａｇ－ＲＧＳ１９邐Ｈ邐１邐逡逑Ｍｙｃ－ＧＮＡＩ３邋—Ｉ—Ｉ邐１－－１邐邋ＨＴ２９－Ｆｌａ￡－ＲＩＰ３逡逑Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３邋邐１邐ｈＨ邐＾邐Ｎｏ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋Ｍｅｄｉｕｍ邋0邋６邐１９邐２４邋ｈ逡逑Ｍｙｃ－ＲＧＳ１９邋邐１－邋＋逡逑－邐ｌＲ邋ｒ／１邐Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３邋ｍｍ邋—？邋ｗｍ邋ａ＊逡逑栜邋ＩＢ：邋Ｍｙｃ逡逑ＩＰ：邋Ｆｌａｇ邐ＩＰ：Ｆｌａｇ邋ＧＮＡＩ３邐Ｗ邋Ｗ逡逑＊＊邐ｍｍ邐—？逡逑ＩＢ：邋Ｆｌａｇ邐ＲＧＳ１９逡逑？邋？逡逑一＾邋邐邋Ｆｌａｇ－ＲＩＰ３邐１逡逑—ＩＢ：邋ＭｙＣ邐ＧＮＡＩ３邐ｉ邐——逡逑Ｉｎｐｕｔ邐—邐—■邐■邐，ｎｐＵｔ邐ＬＣ３－ＩＩ邐邐逡逑ＩＢ：邋Ｆｌａｇ逡逑？邋＾邐ｐ＿Ａｃｔｉｎ逡逑Ａ邐Ｂ逡逑圖３．３免疫共沉淀方法檢測ＲＩＰ３是否與外源性（Ａ）或內(nèi)源性（Ｂ）邋ＧＮＡＩ３和逡逑ＲＧＳ１９相互作用逡逑Ｆｉｇ．３．３邋Ｗｈｅｔｈｅｒ邋ＲＩＰ３邋ｉｎｔｅｒａｃｔｓ邋ｗｉｔｈ邋ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ邋（Ａ）邋ｏｒ邋ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ邋（Ｂ）邋ＧＮＡＩ３邋ａｎｄ逡逑ＲＧＳ１９邋ｂｙ邋Ｃｏ－ＩＰ逡逑３．邋２．邋３邋ＧＮＡ１３或ＲＧＳ１９的表達下調(diào)會抑制葡萄糖饑餓誘導的ＨＴ２９細胞自噬逡逑鑒于ＲＩＰ３能夠與ＧＮＡＩ３和ＲＧＳ１９蛋白相互作用

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 萬德森;;結直腸癌流行病學與預防[J];中國中西醫(yī)結合外科雜志;2011年01期

本文編號：2825502