背景:結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,臨床上主要表現(xiàn)為高發(fā)病率、高轉(zhuǎn)移率、高死亡率。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步已經(jīng)極大改善了結(jié)直腸癌患者的預(yù)后,盡管如此結(jié)直腸癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率、死亡率依然居高不下。造成上述情況的主要原因即是結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。所以,尋找能夠預(yù)測(cè)和診斷結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物是對(duì)抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ),對(duì)于臨床治療、提高患者的生存期和改善預(yù)后具有十分重要的意義。在細(xì)胞和分子水平上,有多種因素共同參與腫瘤的惡變、轉(zhuǎn)移、侵襲等病理過(guò)程。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),缺氧是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的共同特點(diǎn)。缺氧誘導(dǎo)因子-lα(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種在特異性缺氧環(huán)境下仍具有生物學(xué)活性的轉(zhuǎn)錄因子。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失控導(dǎo)致腫瘤組織異常過(guò)快增生,這必將引起局部組織嚴(yán)重缺氧,同時(shí)供能與耗能之間的平衡被打破。上述過(guò)程誘導(dǎo)了 HIF-1α的表達(dá),隨后HIF-1α進(jìn)一步促進(jìn)其靶基因的轉(zhuǎn)錄,因此腫瘤組織供血、供氧以及供能增加,最終促使腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性。HIF-1α通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制參與腫瘤發(fā)展的多個(gè)階段的調(diào)控,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。目前已證實(shí)HIF-1α在多種不同來(lái)源的惡性腫瘤組織中均有表達(dá),其與腫瘤惡性化進(jìn)程之間的相關(guān)性也已成為近幾年腫瘤醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)內(nèi)容。AMPK相關(guān)蛋白激酶5(AMPK-relαted protein kinαse 5,ARK5)也被稱為NUAK1,為Akt下游重要的信號(hào)分子。研究顯示,ARK5活化誘導(dǎo)腫瘤抑制因子ATM磷酸化,進(jìn)而磷酸化其下游基因p53而使其喪失生物學(xué)活性,最終導(dǎo)致基因表達(dá)異常、腫瘤形成。目前已有研究證實(shí),在人類多種惡性腫瘤中均檢測(cè)到了 ARK5的異常表達(dá)。近幾年來(lái),HIF-1α和ARK5在腫瘤組織中的異常表達(dá)逐漸為廣大醫(yī)學(xué)工作者所重視。兩者在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá),且與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在部分腫瘤的診斷分型以及預(yù)后判斷等方面具有一定的價(jià)值。但目前關(guān)于HIF-1α和ARK5在結(jié)直腸癌中表達(dá)意義及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制尚不十分清楚,需進(jìn)一步探索研究。目的:本研究擬檢測(cè)HIF-1α和ARK5在結(jié)直腸癌患者組織中的表達(dá),分析HIF-1α基因沉默后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移以及ARK5表達(dá)的影響,探究HIF-1α在體內(nèi)對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響,旨在了解HIF-1α通過(guò)調(diào)控ARK5促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制,并為結(jié)直腸癌的臨床診斷以及靶向治療提供理論依據(jù)。方法:1、采集60例2014年9月至2015年9月武漢大學(xué)人民醫(yī)院普通外科接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者的癌組織樣本以及相應(yīng)癌旁正常組織樣本。分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot法和免疫組化等技術(shù)檢測(cè)上述組織中HIF-1α和ARK5 mRNA和蛋白的表達(dá),分析HIF-1α和ARK5表達(dá)與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、TNM分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、以及肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系,分析HIF-1α與ARK5在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。2、采用常氧和加入100μmol/LCoCl2(缺氧)的方法培養(yǎng)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α和ARK5 mRNA的的表達(dá)。將SW480隨機(jī)分為3組,control 組:細(xì)胞加入 100 μmol/L 的 CoC12,制備缺氧模型;si-control 組:將 siHIF-1α的對(duì)照質(zhì)粒si-control轉(zhuǎn)染細(xì)胞,隨后向細(xì)胞中加入100umol/L的CoC12;siHIF-1α組:將siHIF-1α轉(zhuǎn)染細(xì)胞,隨后向細(xì)胞中加入100umol/l的CoC12,檢測(cè)上述各組細(xì)胞中HIF-1α和ARK5 mRNA的表達(dá)。檢測(cè)各組細(xì)胞的增值活性(CCK-8法)、細(xì)胞凋亡率(流式細(xì)胞術(shù))、細(xì)胞侵襲能力(Trαnswell法)、細(xì)胞遷移能力(細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn))。3、采用人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480接種裸鼠右肩胛皮下,建立裸鼠結(jié)腸癌SW480細(xì)胞移植瘤模型,觀察成瘤情況。將裸鼠隨機(jī)分為3組,control組:細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),不進(jìn)行任何處理,隨后接種于裸鼠皮下;si-control組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-control質(zhì)粒,隨后接種于裸鼠皮下;siHIF-1α組:將siHIF-1α轉(zhuǎn)染細(xì)胞,隨后接種于裸鼠皮下。每隔5天,游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)度(L)、寬度(W),計(jì)算移植瘤體積,于第20天將裸鼠處死并采集完整的移植瘤組織,稱取重量。采用Western blot法檢測(cè)移植瘤組織中ARK5蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1、與癌旁組織相比,結(jié)直腸癌組織中ARK5和HIF-1α mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著增高(P0.05)。HIF-1α和ARK5蛋白主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中表達(dá)。在60例結(jié)腸癌組織中,HIF-1α和ARK5蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.7%(46/60)和71.7%(43/60)。單因素分析結(jié)果顯示,HIF-1α和ARK5蛋白的表達(dá)與腫瘤分期(分別為73.9%和74.4%)、病理分化程度(分別為78.3%和81.4%)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(分別為82.6%和79.1%)和肝癌轉(zhuǎn)移(分別為32.6%和30.2%)有關(guān)。線性相關(guān)分析評(píng)估HIF-1α和ARK5表達(dá)的關(guān)系,結(jié)果顯示兩者之間存在相關(guān)性(r = 0.776,P = 0.001)。2、與常氧組相比,缺氧組細(xì)胞中ARK5和HIF-1αmRNA的表達(dá)水平均顯著增高(P0.05)。與 si-control 組相比,siHIF-1α組細(xì)胞中 ARK5 和 HIF-1α mRNA的表達(dá)水平顯著下降(P0.05)。上述研究結(jié)果表明,HIF-1α基因沉默的結(jié)直腸癌細(xì)胞系構(gòu)建成功,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí),HIF-1α敲減后ARK5mRNA的表達(dá)量也隨之降低,提示ARK5可能為HIF-1α的下游因子,其表達(dá)受HIF-1α的調(diào)控。control組與si-control組細(xì)胞的增殖活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與si-control組相比,siHIF-1α組細(xì)胞的增殖活性顯著下降(P0.05)。control組與si-control組細(xì)胞凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與si-control組相比,siHIF-1α組細(xì)胞的凋亡率顯著增高(P0.05)。control組與si-control組侵襲細(xì)胞數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與 si-control 組相比,siHIF-1α組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P0.05)。control組與si-control組細(xì)胞遷移率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與si-control組相比,siHIF-1α組細(xì)胞遷移率顯著降低(P0.05)。3、在裸鼠移植成瘤后,各組裸鼠的飲食、活動(dòng)、兩便、膚色均正常,移植瘤組織未發(fā)生破潰。與control組相比,si-control組裸鼠移植瘤體積在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異(P0.05);與si-control組相比,siHIF-1α組裸鼠移植瘤體積在各時(shí)間點(diǎn)均顯著減小(P0.05)。control組相比,si-control組裸鼠移植瘤重量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與si-control組相比,siHIF-1α組裸鼠移植瘤重量顯著減小(P0.05)。與control組相比,si-control組裸鼠移植瘤組織中ARK5蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與si-control組相比,siHIF-1α組裸鼠移植瘤組織中ARK5蛋白的表達(dá)明顯降低(P0.05)。結(jié)論:1、HIF-1α和ARK5在結(jié)直腸癌組織的表達(dá)水平發(fā)生異常上調(diào),其陽(yáng)性表達(dá)率與患者的TNM分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移有關(guān),且HIF-1α與ARK5之間存在正相關(guān)。2、缺氧環(huán)境能夠使人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中HIF-1α和ARK5mRNA的表達(dá)水平增高,HIF-1α通過(guò)上調(diào)ARK5促進(jìn)缺氧條件下人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,抑制凋亡。3、沉默HIF-1α可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng),其機(jī)制可能與HIF-1α表達(dá)抑制后ARK5的表達(dá)水平也隨之下調(diào)有關(guān)。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.34
【部分圖文】：

為了邋了解結(jié)直腸癌組織中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａｍＲＮＡ的表達(dá)水平，本研宄采用逡逑熒光定量ＰＣＲ分別檢測(cè)了結(jié)直腸癌組織以及癌旁相應(yīng)正常組織中ＡＲＫ５和逡逑ＨＩＦ－ｌａｍＲＮＡ的表達(dá)。結(jié)果顯示（圖１－２），與癌旁相應(yīng)組織相比，結(jié)直腸癌組逡逑織中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ邋ｍＲＮＡ的表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義逡逑（Ｐ＜０．０５）0逡逑＾邋＾邐Ｊ－邐■癌旁正常組織逡逑＜邋３－邐＊邐■結(jié)直腸癌組織逡逑｜邋ｉ逡逑Ｉ邋２＇逡逑Ｌ邋＿邋Ｉ邋＿邋Ｊ逡逑ｉＪａｉｉ邋ａｌ邋ｌ逡逑／邋／逡逑圖１－２邋ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ邋ｍＲＮＡ表達(dá)檢測(cè)逡逑注：＊Ｐ為與癌旁正常組織相比，Ｐ＜0．0５逡逑１６逡逑

１邋２逡逑圖１－１瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總ＲＮＡ質(zhì)量逡逑注：１：結(jié)直腸癌組織；２：癌旁相應(yīng)正常組織逡逑１．３．２邋ＡＲＫ５和ＨＩＦ－１邋ａ邋ｍＲＮＡ表達(dá)檢測(cè)結(jié)果逡逑為了邋了解結(jié)直腸癌組織中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａｍＲＮＡ的表達(dá)水平，本研宄采用逡逑熒光定量ＰＣＲ分別檢測(cè)了結(jié)直腸癌組織以及癌旁相應(yīng)正常組織中ＡＲＫ５和逡逑ＨＩＦ－ｌａｍＲＮＡ的表達(dá)。結(jié)果顯示（圖１－２），與癌旁相應(yīng)組織相比，結(jié)直腸癌組逡逑織中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ邋ｍＲＮＡ的表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義逡逑（Ｐ＜０．０５）0逡逑＾邋＾邐Ｊ－邐■癌旁正常組織逡逑＜邋３－邐＊邐■結(jié)直腸癌組織逡逑｜邋ｉ逡逑Ｉ邋２＇逡逑Ｌ邋＿邋Ｉ邋＿邋Ｊ逡逑ｉＪａｉｉ邋ａｌ邋ｌ逡逑／邋／逡逑圖１－２邋ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ邋ｍＲＮＡ表達(dá)檢測(cè)逡逑注：＊Ｐ為與癌旁正常組織相比，Ｐ＜0．0５逡逑１６逡逑

為評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌組織中ＡＲ．Ｋ５和ＨＩＦ－ｌａ蛋白的表達(dá)，運(yùn)用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ法分逡逑別檢測(cè)結(jié)直腸癌組織和癌旁相應(yīng)正常組織中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ蛋白的表達(dá)水平。逡逑結(jié)果顯示（圖１－３），與癌旁相應(yīng)組織相比，結(jié)直腸癌組織中ＡＲＫ５和ＨＩＦ－ｌａ蛋逡逑白的表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜0．0５）。逡逑癌旁正常組織結(jié)直腸癌組織逡逑ａｒｋｓ逡逑ＨＩＦ－ａ逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑１邋５－｜逡逑怕邐■癌旁正常組織逡逑＊邐■■結(jié)直腸癌組織逡逑酬邋１．0＿邐＊邐ｒ＾ｎ逡逑0邐丁逡逑ｉ逡逑ｉ邋ｏ邋ｓ－逡逑ｉ邋ａ邋ｌ逡逑0．0Ｊ￣＾ｍ－ｒ１邐邐＾ｍ￣ｒＡ邐—逡逑／邋／逡逑圖１－３邋ＡＲＫ５和ＨＩＦ－１邋ａ蛋白表達(dá)檢測(cè)逡逑注：＊Ｐ為與癌旁正常組織相比，Ｐ＜0．0５逡逑１．３．４ＨＥ染色結(jié)果逡逑本研宄采用ＨＥ染色法分別對(duì)結(jié)直腸癌組織以及癌旁相應(yīng)正常組織進(jìn)行染逡逑色，用以觀察兩者之間的差異。結(jié)果顯示（圖１－４）：正常結(jié)直腸組織細(xì)胞的大小逡逑基本一致，形態(tài)基本相同，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞核與細(xì)胞漿呈一定逡逑比例。而癌細(xì)胞較正常結(jié)直腸細(xì)胞體積增大，大小不一致，形態(tài)不相同，部分細(xì)逡逑胞形成“瘤巨細(xì)胞”。細(xì)胞核體積亦增大且形態(tài)不相同，能夠觀察到呈雙核、巨核、逡逑多核以及異形核等，細(xì)胞漿與細(xì)胞核之間的比例也不同于正常結(jié)直腸細(xì)胞。逡逑１７逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2824442