量子點(diǎn)(Quantum Dot,QD)是一種半導(dǎo)體納米材料,它具有許多特殊的光學(xué)性質(zhì),包括:高量子產(chǎn)率、高摩爾消光系數(shù)、寬范圍的吸收譜、窄而且對(duì)稱的熒光光譜、大的斯托克斯位移和高的光化學(xué)穩(wěn)定性。量子點(diǎn)的這些特性使它們?cè)谠\斷和生物成像等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。肺癌是一種惡性腫瘤,致死率非常高。發(fā)展有效的肺癌標(biāo)志物檢測技術(shù)具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。作為一類新型的肺癌生物標(biāo)志物,微小核糖核酸(micro RNA或mi RNA)已經(jīng)吸引了研究人員的廣泛關(guān)注。mi RNA是一類由18~25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼單鏈RNA。mi RNA的異常表達(dá)在腫瘤中普遍存在,且具有組織特異性,因而可以作為腫瘤檢測的標(biāo)志物。研究表明,mi RNA涉及到肺癌的多個(gè)階段,包括腫瘤發(fā)展、癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等,因此mi RNA可以用作肺癌檢測的生物標(biāo)志物。在腫瘤的早期,血清中的腫瘤mi RNA標(biāo)志物的濃度是非常低的,因此需要設(shè)計(jì)檢測靈敏度足夠高的傳感器來檢測微量的mi RNA。另一方面,某種特定的腫瘤不是由單一的mi RNA所調(diào)控,通常是多個(gè)高度相關(guān)的mi RNA同時(shí)調(diào)控,而單一mi RNA的檢測特異性和靈敏度仍不夠高,因此聯(lián)合檢測多種mi RNA是進(jìn)行腫瘤早期檢測的一種可行思路。本文通過構(gòu)建量子點(diǎn)-磁珠(QD-MB)生物傳感體系用于實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌標(biāo)志物mi RNA的高靈敏、高特異性的多元檢測。1.QD-MB生物傳感器的構(gòu)建及其對(duì)肺癌mi RNA標(biāo)志物的檢測。首先,利用生物素化的單鏈DNA分別與鏈酶親和素功能化的量子點(diǎn)與磁珠構(gòu)建mi RNA檢測的探針:QD-DNA探針和MB-DNA探針;在含有QD-DNA和MB-DNA探針的緩沖液中加入目標(biāo)肺癌標(biāo)志物mi RNA后,兩種探針分別與mi RNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì),形成一個(gè)“QD-DNA-mi RNA-DNA-MB”的三明治結(jié)構(gòu);接著用磁分離技術(shù)使未被MB-DNA探針捕獲的QD-DNA探針與已經(jīng)形成三明治結(jié)構(gòu)的QD-DNA探針分離,通過檢測上清液中殘留的QD的熒光強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)隨著目標(biāo)mi RNA濃度的增大,量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度逐漸降低,通過對(duì)比未加入mi RNA靶分子前的熒光強(qiáng)度,可實(shí)現(xiàn)對(duì)mi RNA的定量檢測。在工作中,我們構(gòu)建QD-DNA-200b和QD-DNA-21兩種不同的QD-DNA探針,并構(gòu)建了對(duì)應(yīng)的MB-DNA-200b、MB-DNA-21兩種不同的MB-DNA探針,分別用于檢測兩種不同的肺癌標(biāo)志物:mi RNA-200b和mi RNA-21。在Tris-HCl緩沖液中,mi RNA-200b的檢測限達(dá)到0.73 fM,檢測線性范圍是10 fM-10 p M,mi RNA-21檢測限達(dá)到1.16 fM,檢測線性范圍是10 fM-100 p M。為研究傳感器的抗干擾能力,我們進(jìn)一步利用QD-MB生物傳感器對(duì)血清中的mi RNA進(jìn)行了檢測。在1%血清中,mi RNA-200b的檢測限達(dá)到6.09 fM,檢測線性范圍是10 fM-10 p M;mi RNA-21檢測限是3.90 fM,檢測線性范圍是10fM-100 p M。另外,通過對(duì)單堿基錯(cuò)配mi RNA和隨機(jī)序列mi RNA的檢測表明QD-MB傳感器具有較好的檢測特異性。本傳感器可以實(shí)現(xiàn)兩種肺癌標(biāo)志物mi RNA-200b和mi RNA-21的同時(shí)檢測,具有較高的檢測靈敏度和較寬的檢測范圍,而且具有良好的特異性和抗干擾能力,為肺癌的早期診斷提供了技術(shù)支持。2.基于雙鏈特異性核酸內(nèi)切酶(Duplex-specific nuclease,DSN)的QD-MB核酸傳感器的構(gòu)建及其檢測應(yīng)用。DSN能夠高選擇性地識(shí)別并切割完全匹配的DNA雙鏈或者RNA/DNA雜交雙鏈中的DNA,而對(duì)單鏈DNA、RNA或者雙鏈RNA沒有作用�；贒SN的特異性剪切能力,我們?cè)O(shè)計(jì)了基于DSN信號(hào)放大的QD-MB熒光傳感體系。首先,我們以mi RNA-21為靶分子構(gòu)建了基于DSN放大的QD-MB核酸傳感器。加入目標(biāo)mi RNA-21與MB-DNA探針形成DNA-RNA雙鏈,雙鏈中的DNA可被DSN特異性切割,導(dǎo)致mi RNA-21被釋放出來后可以繼續(xù)與DNA探針雜交,引起DSN酶的對(duì)DNA探針的循環(huán)剪切,剪切完畢后與QD-DNA探針雜交,磁分離后檢測上清液量子點(diǎn)的熒光信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn),隨著加入mi RNA-21濃度的增大,量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度逐漸增大。該傳感器的檢測范圍為1 p M-10 nM,達(dá)到4個(gè)數(shù)量級(jí),檢測限達(dá)到120 fM。
【學(xué)位單位】：南京郵電大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 支修益;姚舒洋;;腫瘤標(biāo)志物在肺癌患者管理中的研究進(jìn)展[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年06期

2 任成山;白莉;錢桂生;;慢性阻塞性肺疾病合并肺癌臨床特征及新理念[J];中華肺部疾病雜志(電子版);2015年02期

本文編號(hào)：2819838