目的(1)探討十二指腸胃泌素瘤的起源及與Men1的關(guān)系。(2)建立小鼠十二指腸Glial細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。(3)明確EGF對(duì)小鼠十二指腸原代Glial細(xì)胞中Men1的調(diào)控作用及其機(jī)制。(4)探討Men1基因在小鼠十二指腸胃泌素瘤中的作用。方法(1)免疫熒光技術(shù)檢測人十二指腸胃泌素瘤標(biāo)本中神經(jīng)嵴來源細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP與S100B的表達(dá),同時(shí)檢測腫瘤組織與腫瘤旁正常組織中Menin的表達(dá)水平。(2)利用小鼠十二指腸固有層組織培養(yǎng)原代Glial細(xì)胞,免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測原代細(xì)胞中GFAP,SMA,E-cadherin及Pgp9.5的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測Glial細(xì)胞的純度。(3)EGF作用于小鼠原代Glial細(xì)胞,Q-PCR技術(shù)檢測EGF作用后小鼠原代Glial細(xì)胞中Men1 m RNA的表達(dá)水平,細(xì)胞免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測EGF作用后小鼠原代Glial細(xì)胞中Menin的表達(dá)與分布;Elisa檢測EGF作用后小鼠原代Glial細(xì)胞中胃泌素的分泌情況;生物信息學(xué)方法分析EGF對(duì)Menin作用的可能機(jī)制,然后用免疫熒光,Western blot及免疫沉淀技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。(4)構(gòu)建條件性敲除Men1基因(Gastrin Cre ERT2)與全身性敲除Somatostatin基因小鼠模型(Gastrin Cre ERT2 Men1 fl/fl Sst-/-),同時(shí)對(duì)構(gòu)建的小鼠模型予以奧美拉唑口服治療,觀察小鼠十二指腸胃泌素瘤的形成情況。結(jié)果(1)人十二指腸胃泌素瘤標(biāo)本中神經(jīng)嵴來源細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP與S100B均陽性。與腫瘤周圍正常組織相比,人胃泌素瘤組織中Menin的表達(dá)水平較低,且主要分布于胞漿。(2)成功地從小鼠十二指腸固有層中培養(yǎng)出了GFAP陽性的原代細(xì)胞(原代Glial細(xì)胞);經(jīng)免疫熒光和Western blot技術(shù)檢測,原代細(xì)胞中GFAP陽性,但SMA,E-cadherin及Pgp9.5陰性;流式細(xì)胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)GFAP陽性細(xì)胞的百分比達(dá)96%。(3)EGF作用于小鼠原代Glial細(xì)胞后,Men1 m RNA水平無明顯改變,但Menin蛋白先核輸出,然后在胞質(zhì)中降解,且細(xì)胞分泌的胃泌素水平明顯升高;生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Erk2與Akt可能參與了EGF介導(dǎo)的Menin核輸出和胞質(zhì)降解,Western blot與免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGF作用后,Erk2與Akt被磷酸化,然后分別與Menin在胞核與胞質(zhì)中結(jié)合,應(yīng)用Erk2與Akt抑制劑后,Menin的核輸出與胞質(zhì)降解被阻滯。進(jìn)一步用免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGF作用后,Menin的泛素化水平升高。(4)經(jīng)過長達(dá)6個(gè)月的觀察,條件性敲除小鼠Men1基因(Gastrin Cre ERT2)與全身性敲除Somatostatin基因,并輔以奧美拉唑治療,小鼠十二指腸內(nèi)無胃泌素瘤形成,血清胃泌素的水平無明顯升高,十二指腸內(nèi)Gastrin陽性細(xì)胞數(shù)也無顯著增加。結(jié)論(1)十二指腸胃泌素瘤可能起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞(Glial細(xì)胞);Men1與十二指腸胃泌素瘤具有相關(guān)性。(2)我們成功地從小鼠十二指腸固有層中分離出原代Glial細(xì)胞;其純度達(dá)96%,可用于體外實(shí)驗(yàn)研究。(3)EGF通過激活Erk2與Akt介導(dǎo)小鼠原代Glial細(xì)胞中Menin蛋白的核輸出,并在胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,而Menin的降解促進(jìn)十二指腸Glial細(xì)胞中胃泌素的釋放。這說明EGF可以通過下調(diào)Menin的表達(dá)促進(jìn)Glial細(xì)胞向胃泌素瘤轉(zhuǎn)化。(4)Men1條件性敲除短期內(nèi)(Gastrin Cre,6個(gè)月)并不能誘導(dǎo)小鼠十二指腸胃泌素瘤的形成,更長時(shí)間的觀察及其他條件性敲除(如GFAP Cre)小鼠的構(gòu)建將是下一步的研究方向。第一部分十二指腸胃泌素瘤的起源及與Men1的關(guān)系目的:探討十二指腸胃泌素瘤的起源及與Men1的關(guān)系。方法:免疫熒光技術(shù)檢測人十二指腸胃泌素瘤標(biāo)本中神經(jīng)嵴來源細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP與S100B的表達(dá),同時(shí)檢測腫瘤組織與腫瘤旁正常組織中Menin的表達(dá)水平。結(jié)果:人十二指腸胃泌素瘤標(biāo)本中神經(jīng)嵴來源細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP與S100B均陽性。與腫瘤周圍正常組織相比,人胃泌素瘤組織中Menin的表達(dá)水平較低,且主要分布于胞漿。結(jié)論:十二指腸胃泌素瘤可能起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞(Glial細(xì)胞);Men1與十二指腸胃泌素瘤具有相關(guān)性。第二部分小鼠十二指腸原代Glial細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定目的:建立小鼠十二指腸Glial細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。方法:利用小鼠十二指腸固有層組織培養(yǎng)原代Glial細(xì)胞,免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測原代細(xì)胞中GFAP(神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)志物),SMA(成肌纖維細(xì)胞的標(biāo)志物),E-cadherin(上皮細(xì)胞的標(biāo)志物)及Pgp9.5(神經(jīng)元細(xì)胞的標(biāo)志物)的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測Glial細(xì)胞的純度。結(jié)果:成功地從小鼠十二指腸固有層中培養(yǎng)出了GFAP陽性的原代細(xì)胞(原代Glial細(xì)胞);經(jīng)免疫熒光和Western blot技術(shù)檢測,原代細(xì)胞中GFAP陽性,但SMA,E-cadherin及Pgp9.5陰性;流式細(xì)胞技術(shù)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)GFAP陽性細(xì)胞的百分比達(dá)96%。結(jié)論:我們成功地從小鼠十二指腸固有層中分離出原代Glial細(xì)胞;其純度達(dá)96%,可用于體外實(shí)驗(yàn)研究。第三部分EGF對(duì)小鼠十二指腸原代Glial細(xì)胞中Men1的調(diào)控作用及其機(jī)制目的:明確EGF對(duì)小鼠十二指腸原代Glial細(xì)胞中Men1的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法:EGF作用于小鼠原代Glial細(xì)胞,Q-PCR技術(shù)檢測EGF作用后小鼠原代Glial細(xì)胞中Men1 m RNA的表達(dá)水平,細(xì)胞免疫熒光及Western blot技術(shù)檢測EGF作用后小鼠原代Glial細(xì)胞中Menin的表達(dá)與分布;Elisa檢測EGF作用后小鼠原代Glial細(xì)胞中胃泌素的分泌情況;生物信息學(xué)方法分析EGF對(duì)Menin作用的可能機(jī)制,然后用免疫熒光,Western blot及免疫沉淀技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。另外,利用小鼠十二指腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞株STC1重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:EGF作用于小鼠原代Glial細(xì)胞后,Men1 m RNA水平無明顯改變,但Menin蛋白先核輸出,然后在胞質(zhì)中降解;且細(xì)胞分泌的胃泌素水平明顯升高;生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Erk2與Akt可能參與了EGF介導(dǎo)的Menin核輸出和胞質(zhì)降解,Western blot與免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGF作用后,Erk2與Akt被磷酸化,然后分別與Menin在胞核與胞質(zhì)中結(jié)合,應(yīng)用Erk2與Akt抑制劑后,Menin的核輸出與胞質(zhì)降解被阻滯。進(jìn)一步用免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)EGF作用后,Menin的泛素化水平升高。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以在STC1細(xì)胞株中重復(fù)。結(jié)論:EGF通過激活Erk2與Akt介導(dǎo)小鼠原代Glial細(xì)胞中Menin蛋白的核輸出,并在胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,而Menin的降解促進(jìn)十二指腸Glial細(xì)胞中胃泌素的釋放。這說明EGF可以通過下調(diào)Menin的表達(dá)促進(jìn)Glial細(xì)胞向胃泌素瘤轉(zhuǎn)化。第四部分條件性敲除Men1對(duì)小鼠血清胃泌素水平及十二指腸胃泌素瘤形成的影響目的:探討Men1基因在小鼠十二指腸胃泌素瘤中的作用。方法:構(gòu)建條件性敲除小鼠Men1基因(Gastrin Cre ERT2)與全身性敲除Somatostatin基因小鼠模型(Gastrin Cre ERT2 Men1 fl/fl Sst-/-),同時(shí)對(duì)構(gòu)建的小鼠模型予以奧美拉唑口服治療,觀察小鼠十二指腸胃泌素瘤的形成情況。結(jié)果:經(jīng)過長達(dá)6個(gè)月的觀察,條件性敲除小鼠Men1基因(Gastrin Cre ERT2)與全身性敲除Somatostatin基因,并輔以奧美拉唑治療,小鼠十二指腸內(nèi)無胃泌素瘤形成,血清胃泌素的水平無明顯升高,十二指腸內(nèi)Gastrin陽性細(xì)胞數(shù)也無顯著增加。結(jié)論:Men1條件性敲除短期內(nèi)(Gastrin Cre,6個(gè)月)并不能誘導(dǎo)小鼠十二指腸胃泌素瘤的形成,更長時(shí)間的觀察及其他條件性敲除(如GFAP Cre)小鼠的構(gòu)建將是下一步的研究方向。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.31
【部分圖文】：

99圖 1 人十二指腸胃泌素瘤 HE 及免疫組化染色結(jié)果A-B 人十二指腸胃泌素瘤的 HE 染色結(jié)果（A: 20 倍鏡；B: 100 倍鏡）；C-D 十二指腸胃泌瘤 Gastrin 免疫組化染色結(jié)果（C: 20 倍鏡；D: 100 倍鏡））

圖 2 人十二指腸胃泌素瘤 Gastrin 與 GFAP 免疫熒光染色結(jié)果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: GFAP 染色；D: 融合圖像）圖 3 人十二指腸胃泌素瘤 Gastrin 與 S100B 免疫熒光染色結(jié)果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: S100B 染色；D: 融合圖像）

圖 2 人十二指腸胃泌素瘤 Gastrin 與 GFAP 免疫熒光染色結(jié)果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: GFAP 染色；D: 融合圖像）圖 3 人十二指腸胃泌素瘤 Gastrin 與 S100B 免疫熒光染色結(jié)果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: S100B 染色；D: 融合圖像）

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