發(fā)布時間：2020-09-15 21:26

　　 目的(1)探討十二指腸胃泌素瘤的起源及與Men1的關系。(2)建立小鼠十二指腸Glial細胞原代培養(yǎng)的方法。(3)明確EGF對小鼠十二指腸原代Glial細胞中Men1的調控作用及其機制。(4)探討Men1基因在小鼠十二指腸胃泌素瘤中的作用。方法(1)免疫熒光技術檢測人十二指腸胃泌素瘤標本中神經(jīng)嵴來源細胞的標志物GFAP與S100B的表達,同時檢測腫瘤組織與腫瘤旁正常組織中Menin的表達水平。(2)利用小鼠十二指腸固有層組織培養(yǎng)原代Glial細胞,免疫熒光及Western blot技術檢測原代細胞中GFAP,SMA,E-cadherin及Pgp9.5的表達,流式細胞術檢測Glial細胞的純度。(3)EGF作用于小鼠原代Glial細胞,Q-PCR技術檢測EGF作用后小鼠原代Glial細胞中Men1 m RNA的表達水平,細胞免疫熒光及Western blot技術檢測EGF作用后小鼠原代Glial細胞中Menin的表達與分布;Elisa檢測EGF作用后小鼠原代Glial細胞中胃泌素的分泌情況;生物信息學方法分析EGF對Menin作用的可能機制,然后用免疫熒光,Western blot及免疫沉淀技術進行驗證。(4)構建條件性敲除Men1基因(Gastrin Cre ERT2)與全身性敲除Somatostatin基因小鼠模型(Gastrin Cre ERT2 Men1 fl/fl Sst-/-),同時對構建的小鼠模型予以奧美拉唑口服治療,觀察小鼠十二指腸胃泌素瘤的形成情況。結果(1)人十二指腸胃泌素瘤標本中神經(jīng)嵴來源細胞的標志物GFAP與S100B均陽性。與腫瘤周圍正常組織相比,人胃泌素瘤組織中Menin的表達水平較低,且主要分布于胞漿。(2)成功地從小鼠十二指腸固有層中培養(yǎng)出了GFAP陽性的原代細胞(原代Glial細胞);經(jīng)免疫熒光和Western blot技術檢測,原代細胞中GFAP陽性,但SMA,E-cadherin及Pgp9.5陰性;流式細胞技術檢測發(fā)現(xiàn)GFAP陽性細胞的百分比達96%。(3)EGF作用于小鼠原代Glial細胞后,Men1 m RNA水平無明顯改變,但Menin蛋白先核輸出,然后在胞質中降解,且細胞分泌的胃泌素水平明顯升高;生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Erk2與Akt可能參與了EGF介導的Menin核輸出和胞質降解,Western blot與免疫沉淀技術發(fā)現(xiàn)EGF作用后,Erk2與Akt被磷酸化,然后分別與Menin在胞核與胞質中結合,應用Erk2與Akt抑制劑后,Menin的核輸出與胞質降解被阻滯。進一步用免疫沉淀技術發(fā)現(xiàn)EGF作用后,Menin的泛素化水平升高。(4)經(jīng)過長達6個月的觀察,條件性敲除小鼠Men1基因(Gastrin Cre ERT2)與全身性敲除Somatostatin基因,并輔以奧美拉唑治療,小鼠十二指腸內(nèi)無胃泌素瘤形成,血清胃泌素的水平無明顯升高,十二指腸內(nèi)Gastrin陽性細胞數(shù)也無顯著增加。結論(1)十二指腸胃泌素瘤可能起源于神經(jīng)嵴細胞(Glial細胞);Men1與十二指腸胃泌素瘤具有相關性。(2)我們成功地從小鼠十二指腸固有層中分離出原代Glial細胞;其純度達96%,可用于體外實驗研究。(3)EGF通過激活Erk2與Akt介導小鼠原代Glial細胞中Menin蛋白的核輸出,并在胞質內(nèi)經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,而Menin的降解促進十二指腸Glial細胞中胃泌素的釋放。這說明EGF可以通過下調Menin的表達促進Glial細胞向胃泌素瘤轉化。(4)Men1條件性敲除短期內(nèi)(Gastrin Cre,6個月)并不能誘導小鼠十二指腸胃泌素瘤的形成,更長時間的觀察及其他條件性敲除(如GFAP Cre)小鼠的構建將是下一步的研究方向。第一部分十二指腸胃泌素瘤的起源及與Men1的關系目的:探討十二指腸胃泌素瘤的起源及與Men1的關系。方法:免疫熒光技術檢測人十二指腸胃泌素瘤標本中神經(jīng)嵴來源細胞的標志物GFAP與S100B的表達,同時檢測腫瘤組織與腫瘤旁正常組織中Menin的表達水平。結果:人十二指腸胃泌素瘤標本中神經(jīng)嵴來源細胞的標志物GFAP與S100B均陽性。與腫瘤周圍正常組織相比,人胃泌素瘤組織中Menin的表達水平較低,且主要分布于胞漿。結論:十二指腸胃泌素瘤可能起源于神經(jīng)嵴細胞(Glial細胞);Men1與十二指腸胃泌素瘤具有相關性。第二部分小鼠十二指腸原代Glial細胞的培養(yǎng)與鑒定目的:建立小鼠十二指腸Glial細胞原代培養(yǎng)的方法。方法:利用小鼠十二指腸固有層組織培養(yǎng)原代Glial細胞,免疫熒光及Western blot技術檢測原代細胞中GFAP(神經(jīng)嵴細胞標志物),SMA(成肌纖維細胞的標志物),E-cadherin(上皮細胞的標志物)及Pgp9.5(神經(jīng)元細胞的標志物)的表達,流式細胞術檢測Glial細胞的純度。結果:成功地從小鼠十二指腸固有層中培養(yǎng)出了GFAP陽性的原代細胞(原代Glial細胞);經(jīng)免疫熒光和Western blot技術檢測,原代細胞中GFAP陽性,但SMA,E-cadherin及Pgp9.5陰性;流式細胞技術技術檢測發(fā)現(xiàn)GFAP陽性細胞的百分比達96%。結論:我們成功地從小鼠十二指腸固有層中分離出原代Glial細胞;其純度達96%,可用于體外實驗研究。第三部分EGF對小鼠十二指腸原代Glial細胞中Men1的調控作用及其機制目的:明確EGF對小鼠十二指腸原代Glial細胞中Men1的調控作用及其機制。方法:EGF作用于小鼠原代Glial細胞,Q-PCR技術檢測EGF作用后小鼠原代Glial細胞中Men1 m RNA的表達水平,細胞免疫熒光及Western blot技術檢測EGF作用后小鼠原代Glial細胞中Menin的表達與分布;Elisa檢測EGF作用后小鼠原代Glial細胞中胃泌素的分泌情況;生物信息學方法分析EGF對Menin作用的可能機制,然后用免疫熒光,Western blot及免疫沉淀技術進行驗證。另外,利用小鼠十二指腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞株STC1重復上述實驗。結果:EGF作用于小鼠原代Glial細胞后,Men1 m RNA水平無明顯改變,但Menin蛋白先核輸出,然后在胞質中降解;且細胞分泌的胃泌素水平明顯升高;生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Erk2與Akt可能參與了EGF介導的Menin核輸出和胞質降解,Western blot與免疫沉淀技術發(fā)現(xiàn)EGF作用后,Erk2與Akt被磷酸化,然后分別與Menin在胞核與胞質中結合,應用Erk2與Akt抑制劑后,Menin的核輸出與胞質降解被阻滯。進一步用免疫沉淀技術發(fā)現(xiàn)EGF作用后,Menin的泛素化水平升高。上述實驗結果可以在STC1細胞株中重復。結論:EGF通過激活Erk2與Akt介導小鼠原代Glial細胞中Menin蛋白的核輸出,并在胞質內(nèi)經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解,而Menin的降解促進十二指腸Glial細胞中胃泌素的釋放。這說明EGF可以通過下調Menin的表達促進Glial細胞向胃泌素瘤轉化。第四部分條件性敲除Men1對小鼠血清胃泌素水平及十二指腸胃泌素瘤形成的影響目的:探討Men1基因在小鼠十二指腸胃泌素瘤中的作用。方法:構建條件性敲除小鼠Men1基因(Gastrin Cre ERT2)與全身性敲除Somatostatin基因小鼠模型(Gastrin Cre ERT2 Men1 fl/fl Sst-/-),同時對構建的小鼠模型予以奧美拉唑口服治療,觀察小鼠十二指腸胃泌素瘤的形成情況。結果:經(jīng)過長達6個月的觀察,條件性敲除小鼠Men1基因(Gastrin Cre ERT2)與全身性敲除Somatostatin基因,并輔以奧美拉唑治療,小鼠十二指腸內(nèi)無胃泌素瘤形成,血清胃泌素的水平無明顯升高,十二指腸內(nèi)Gastrin陽性細胞數(shù)也無顯著增加。結論:Men1條件性敲除短期內(nèi)(Gastrin Cre,6個月)并不能誘導小鼠十二指腸胃泌素瘤的形成,更長時間的觀察及其他條件性敲除(如GFAP Cre)小鼠的構建將是下一步的研究方向。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.31
【部分圖文】：

99圖 1 人十二指腸胃泌素瘤 HE 及免疫組化染色結果A-B 人十二指腸胃泌素瘤的 HE 染色結果（A: 20 倍鏡；B: 100 倍鏡）；C-D 十二指腸胃泌瘤 Gastrin 免疫組化染色結果（C: 20 倍鏡；D: 100 倍鏡））

圖 2 人十二指腸胃泌素瘤 Gastrin 與 GFAP 免疫熒光染色結果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: GFAP 染色；D: 融合圖像）圖 3 人十二指腸胃泌素瘤 Gastrin 與 S100B 免疫熒光染色結果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: S100B 染色；D: 融合圖像）

圖 2 人十二指腸胃泌素瘤 Gastrin 與 GFAP 免疫熒光染色結果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: GFAP 染色；D: 融合圖像）圖 3 人十二指腸胃泌素瘤 Gastrin 與 S100B 免疫熒光染色結果（A: DAPI 染色；B: Gastrin 染色； C: S100B 染色；D: 融合圖像）

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3 陳原稼;A.Vortmeyer;R.T.Jensen;;胃泌素瘤1q雜合缺失與腫瘤的進展和肝轉移相關并提示1q31～32存在抑癌基因[A];中華醫(yī)學會消化病學分會——2005年全國胃腸激素學術研討會論文集[C];2005年

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本文編號：2819486