【摘要】：乳腺癌是現(xiàn)今危害女性健康的主要原因之一,其機理復雜,迄今尚未明確。非編碼RNA(ncRNA)是表觀遺傳修飾的一種,其較編碼基因具有更廣泛的調(diào)控網(wǎng)絡和調(diào)控機制,是如今腫瘤機制研究的一個熱點話題。ncRNA根據(jù)其長度有可分為短ncRNA和長ncRNA(LncRNA)。LncRNAs表達水平比蛋白質(zhì)編碼基因低,但其表達具細胞/組織特異性,涉及多種生理和病理過程。本課題主要研究LncRNA在乳腺癌細胞增殖中的作用。本課題首先通過高通量測序,遴選在良性和惡性乳腺癌細胞中差異表達的LncRNAs,篩選出了尚未報道過的LncNONHSAT028712(簡稱Lnc712)。并且通過熒光定量PCR進一步驗證了這一基因在乳腺癌細胞中的表達高于人非致瘤性細胞。隨后通過轉染LncRNA Smart Silencer干擾以及流式細胞實驗的方法分析了Lnc712在乳腺癌細胞中的生物學功能,發(fā)現(xiàn)轉染LncRNA Smart Silencer敲低Lnc712的表達后,乳腺癌細胞的存活率下降,并且細胞停滯在G1期,而不進入S期,導致細胞周期被破壞,細胞的增殖受到限制。實驗結果隨后顯示細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK2)在mRNA水平和蛋白水平的表達均隨Lnc712的敲低而降低,提示Lnc712可以通過調(diào)節(jié)CDK2的表達來調(diào)控細胞周期的進程。基于上述的推論,進一步研究了Lnc712調(diào)控CDK2的機制。首先用RNA pull down實驗和質(zhì)譜實驗分析并篩選出了與Lnc712直接結合的蛋白HSP90,并通過蛋白免疫印跡再次驗證了兩者之間的結合。隨后熒光定量PCR和蛋白免疫印跡實驗結果顯示CDK2在mRNA水平和蛋白水平的表達均隨HSP90的敲低而降低,說明HSP90可以調(diào)控CDK2的表達。通過查閱已有的文獻報道發(fā)現(xiàn),HSP90與Cdc37形成的復合物HSP90/Cdc37可以調(diào)節(jié)下游CDK2的穩(wěn)定性。免疫共沉淀結果顯示,在乳腺癌細胞中沉默Lnc712表達后,HSP90與Cdc37的結合被破壞。提示Lnc712可能通過破壞HSP90/Cdc37復合物的形成調(diào)節(jié)CDK2的表達。綜上所述,本課題首先篩選出了在乳腺癌細胞中異常高表達的Lnc712,進一步實驗又驗證了Lnc712可以通過調(diào)控HSP90與其輔助分子伴侶Cdc37的結合,調(diào)節(jié)下游CDK2的表達,從而調(diào)控細胞周期,影響乳腺癌細胞的增殖。因為細胞的無限制增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要因素,所以本課題的發(fā)現(xiàn)有望為尋找腫瘤治療的新靶點提供可能方向,值得進一步的研究和探索。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

細胞周期能否順利啟動的關鍵點在于 G1 期，細胞能否殖的關鍵點。G1 期相關調(diào)節(jié)因子有 CyclinD、CyclinE、CD 聚集出現(xiàn)在 G1 晚期，與 CDK4 相結合，形成 CyclinD/C合位點附近的一個保守蘇氨酸被磷酸化后，其酶活性達到 G高點時，視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（pRb）磷酸化，然后釋放與E2F 進而促進 CyclinE 與 CDK2 結合成 CyclinE/CDK合物經(jīng)過磷酸化修飾后，又可反過來抑制 pRb 的表達，進一 DHFR、polⅡ等多種與 DNA 復制相關的基因表達，使細進入 S 期后，CyclinE 被泛素化降解，CDK2 隨后又與 CyA 的復制。G2 期主要由 CDK1 先后形成的復合物 Cycli行調(diào)節(jié)，其中起主要作用的是 CyclinB/CDK1，它與細胞成被稱為成熟促進因子(MPF)，MPF 可通過磷酸化修飾多種與如核層連蛋白、組蛋白、微管蛋白等。M 期是細胞周期中的末期被泛素化降解，有絲分裂終止[51, 53-56]。

圖 1-2 HSP90 構象循環(huán)Fig.1-2 HSP90 conformation cycle輔助分子伴侶相互作用，一同維持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。HSP90，然后允許具有酶活性的其他輔助分子伴侶折疊或修復輔助分子伴侶分為兩類：一類是通過四分體肽（TPR）結為不需要 TPR 結構域而與 HSP90 結合的。大部分為第P90 中發(fā)現(xiàn)的 MEEVD 基序以及 Hsp70 中的 EEVD 基序[70-相互作用蛋白（CHIP），Hsp70-相互作用蛋白（HIP），，蛋白磷酸酶 5（PP5）和幾種具有肽基-脯氨酰異構酶（FK506 結合蛋白，肽基脯氨酰異構酶 D（PPID）/親環(huán)蛋白 Tom7046 等[71]。不需要 TPR 結構域即可與 HSP90 結合CDC37），HSP90 ATPase（Aha）1 和 p23 的激活劑[88,HSP90 ATP 酶活性，影響下游蛋白的新陳代謝。因此，藥物靶標[90]。大量研究表明在不同核苷酸和輔助伴侶存在構象也不相同。研究人員根據(jù)大量研究數(shù)據(jù)提出了 HSP9

第三章 實驗結果與討論 Lnc712 在乳腺癌細胞中高表達1 微陣列分析篩選乳腺癌細胞中差異表達的 LncRNAs對良性乳腺癌細胞株 MCF-7/WT 和惡性乳腺癌細胞株 MCF-7/ADM 進行表達列分析（包括編碼、非編碼 RNA），分析 LncRNAs 在這兩株細胞中的表達情出在這兩株細胞中表達有差異的 LncRNAs。分析結果如圖 3-1 所示，圖 A 中表示在兩株細胞中表達具統(tǒng)計學差異的基因。圖 B 中紅色的表示表達量高的基的表示表達量較低的。通過相關數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，在 MCF-7/ADM 細胞中，有ncRNA 和未標注的轉錄物上調(diào)，3708 個下調(diào)（圖 3-1 A），而有 3423 個 mRN2950 個下調(diào)（圖 3-1 B，倍數(shù)變化≥ 2，P < 0.05）。在這 4030 個基因中，Lnc712 在兩株細胞中的差異性是較為顯著的，該基F-7/ADM 中高表達，在 MCF-7/WT 中低表達，說明 Lnc712 在乳腺癌惡性腫瘤表達相較于良性乳腺癌細胞中高。

【參考文獻】

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本文編號：2818546