腫瘤因其發(fā)病率高、死亡率高成為威脅人類健康的最大疾病。腫瘤發(fā)生時多為器官局限性疾病,但最終幾乎都會通過血液或淋巴傳播到遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移。大多數(shù)腫瘤患者死于轉(zhuǎn)移性腫瘤,而非原發(fā)性腫瘤,腫瘤的轉(zhuǎn)移成為導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cell,CTC)作為腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志越來越受到重視,CTC的數(shù)目可以用來評估腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)程,也可以作為腫瘤患者的預(yù)后判斷、化療藥物的快速評估、腫瘤復(fù)發(fā)等的重要指標(biāo)。目前CTC檢測技術(shù)多為體外檢測,依賴采血。主要是利用循環(huán)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、免疫學(xué)特征以及流式細(xì)胞技術(shù)等原理來捕獲CTC。目前的這些方法均存在著復(fù)雜的樣品制備和采集過程,在這個過程中容易造成細(xì)胞的污染、漏檢、假陽性等一系列的問題,且受到抽血量的影響,檢測靈敏度受限,難以頻繁采血實(shí)現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測,比如在腫瘤化療療程進(jìn)行中的療效評估等。為了解決現(xiàn)有離體檢測CTC技術(shù)中存在的問題,本論文進(jìn)行了針對CTC在體無創(chuàng)實(shí)時監(jiān)測的研究。該CTC在體檢測技術(shù)結(jié)合了實(shí)時高速熒光影像技術(shù)以及流式細(xì)胞檢測的概念來獲取實(shí)時、高信噪比的腫瘤細(xì)胞信號來動態(tài)監(jiān)測活體(小動物或人體)血循環(huán)內(nèi)某個(某些)靶細(xì)胞群體的存在,如實(shí)體瘤血液播散后在血循環(huán)中的轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞,并進(jìn)行定量分析。由于無需抽血,該技術(shù)能有效避免現(xiàn)有體外檢測技術(shù)由抽血所引起的細(xì)胞污染、漏檢、假陽性等問題,同時可以對同一實(shí)驗(yàn)個體進(jìn)行長時間的監(jiān)測,從而提高了檢測靈敏度。因此,該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了實(shí)時動態(tài)無損監(jiān)測CTC,而且有助于我們理解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程以及發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為腫瘤轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究和診斷治療提供一個新的技術(shù)手段。首先,論文在單一激光波長活體流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)上,利用激光共聚焦的原理將不同波長的激光聚焦到同一平面上,研制了基于熒光標(biāo)記的多波長活體流式細(xì)胞儀。我們利用基于熒光標(biāo)記的多波長活體流式細(xì)胞儀通過對小鼠前列腺癌皮下腫瘤模型和原位腫瘤模型中CTC數(shù)量、腫瘤體積以及存活率的監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)了原位腫瘤模型循環(huán)系統(tǒng)中的CTC數(shù)量遠(yuǎn)高于皮下腫瘤模型循環(huán)系統(tǒng)中的CTC的數(shù)量,且成爆發(fā)式增長,皮下腫瘤模型循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)CTC的數(shù)量呈漸進(jìn)式增長,腫瘤的體積也呈漸進(jìn)式增長;皮下腫瘤模型小鼠的存活率也高于原位腫瘤模型小鼠。該研究結(jié)果從一定程度上解釋了腫瘤生長微環(huán)境對腫瘤血源性轉(zhuǎn)移造成的影響;同時發(fā)現(xiàn)原位腫瘤模型的腫瘤進(jìn)展?fàn)顩r接近于臨床表現(xiàn),表明原位腫瘤模型更適合研究腫瘤的轉(zhuǎn)移。以上基于熒光標(biāo)記的活體流式細(xì)胞儀雖然為CTC的檢測提供了一個有力工具,但是由于其檢測還依賴于將腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外熒光標(biāo)記后注入體內(nèi),或在體內(nèi)進(jìn)行熒光標(biāo)記,目前該技術(shù)僅局限于實(shí)驗(yàn)室動物研究,難以應(yīng)用于臨床。為了解決活體檢測熒光標(biāo)記的問題,我們進(jìn)一步研究開發(fā)了基于光聲效應(yīng)的無標(biāo)記活體流式細(xì)胞儀。本研究利用黑色素瘤細(xì)胞和血液背景在近紅外波段具有顯著的吸收差異即光聲信號的差異,以及近紅外光/聲信號在組織中的較小吸收/散射的特點(diǎn),實(shí)現(xiàn)高靈敏、較大穿透深度的無標(biāo)記活體檢測。首先,我們對黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生光聲信號的邊界條件進(jìn)行了理論計(jì)算,并根據(jù)計(jì)算結(jié)果確定了激發(fā)光源的各項(xiàng)參數(shù),通過對黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生光聲信號的特點(diǎn)進(jìn)行理論計(jì)算和分析,根據(jù)其特征確定了光聲信號接收裝置的參數(shù),并對測得的細(xì)胞光聲信號用小波去噪和平均去噪方法進(jìn)行去噪處理及數(shù)據(jù)分析,發(fā)展了基于光聲效應(yīng)的無標(biāo)記活體流式細(xì)胞儀。在此基礎(chǔ)上,我們利用黑色素瘤小鼠模型對活體小鼠體內(nèi)循環(huán)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行了無標(biāo)記、實(shí)時、動態(tài)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),我們總結(jié)了小鼠體內(nèi)的CTC隨著時間的推移其數(shù)量在不斷增加,同時發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腫瘤附近的動脈比遠(yuǎn)端動脈具有更高的檢測效率。該結(jié)果證明了基于光聲效應(yīng)的無標(biāo)記活體流式細(xì)胞儀可以實(shí)現(xiàn)對循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞的無標(biāo)記檢測。本研究使用CTC無標(biāo)記光學(xué)定量檢測,將黑色素瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞的光聲信號作為活體流式細(xì)胞儀的檢測信號,從而實(shí)現(xiàn)CTC無標(biāo)記、在體、實(shí)時、動態(tài)監(jiān)測,為有效解決活體流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)應(yīng)用于臨床所面臨的最大問題提供了一種切實(shí)可行的辦法。雖然以上基于光聲效應(yīng)的活體流式細(xì)胞儀對小鼠循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞的監(jiān)測結(jié)果證明了該技術(shù)進(jìn)行在體無標(biāo)記檢測的可行性,但是由于前期的研究仍是以動物為研究對象,在很多方面與臨床應(yīng)用仍有一定的差異。首先,在光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)上,臨床應(yīng)用對光路的穩(wěn)定性、小型化、便攜性等要求更高。其次,在動物實(shí)驗(yàn)平臺所采用的對待測血管進(jìn)行圖像導(dǎo)航以便精準(zhǔn)定位的方法受人體皮膚較厚的影響在臨床上無法對人體待測血管進(jìn)行精準(zhǔn)定位。第三,在臨床應(yīng)用中,人體循環(huán)系統(tǒng)的血流速度、血管大小等和動物均有著一定的差異。最后臨床系統(tǒng)中所采用激光要必須滿足臨床安全要求。因此為了將活體無標(biāo)記檢測技術(shù)應(yīng)用于臨床,我們首先對基于光聲效應(yīng)的無標(biāo)記活體流式細(xì)胞儀的光路進(jìn)行微型化設(shè)計(jì),我們采用微型雙彎月透鏡組和雙膠合透鏡組對激光光斑進(jìn)行整形聚焦,設(shè)計(jì)了適合人體腕部佩戴的光聲監(jiān)測手環(huán),從而形成一個可以佩戴在人體腕部,能對腕部血循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測的可穿戴設(shè)備。其次,我們通過激光倍頻技術(shù)將1064 nm波長的激發(fā)光進(jìn)行倍頻產(chǎn)生532 nm波長的激光,利用皮膚和血管被532 nm波長激光所照射產(chǎn)生超聲信號的差異性,設(shè)計(jì)了信號導(dǎo)航系統(tǒng),從而實(shí)現(xiàn)了對人體腕部待測血管的精準(zhǔn)定位。最后,我們通過對人體的血管直徑、血流速度、激光安全要求等參數(shù)進(jìn)行理論計(jì)算與分析,最終確定了設(shè)備各個器件的技術(shù)指標(biāo),并利用該儀器對靜態(tài)組織黑色素以及體外懸浮黑色素瘤細(xì)胞的光聲信號進(jìn)行了檢測;實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步驗(yàn)證了系統(tǒng)設(shè)計(jì)的合理性、參數(shù)選擇的科學(xué)性以及配套軟件的實(shí)用性。設(shè)備的應(yīng)用有望在臨床上實(shí)現(xiàn)早期在體實(shí)時監(jiān)測人體循環(huán)系統(tǒng)中的黑色素瘤細(xì)胞,在幫助醫(yī)生評估黑色素瘤轉(zhuǎn)移狀況,對黑色素瘤患者進(jìn)行個體化療效動態(tài)評估以及監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R730.4
【部分圖文】：

文 于腫瘤等疾病的早期診斷和血細(xì)胞的免疫及腫瘤治療療效進(jìn)行評估提供了一種新的突紹該技術(shù)的原理、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，設(shè)計(jì)胞儀，進(jìn)一步擴(kuò)展儀器的應(yīng)用范圍，為癌基于熒光標(biāo)記的三通道活體流式細(xì)胞儀對進(jìn)行監(jiān)測，研究皮下腫瘤模型和原位腫瘤量之間的相關(guān)性及其機(jī)制分析。記的活體流式細(xì)胞儀國內(nèi)外研究現(xiàn)狀佛醫(yī)學(xué)院Charles P. Lin等人首次報(bào)道了一Vivo Flow Cytometry，IVFC）[99]，圖 2-1 細(xì)胞儀的基本原理圖。

分析 CTC 轉(zhuǎn)移的機(jī)理。記的多波長活體流式細(xì)胞儀的研制的活體流式細(xì)胞儀可以解決活體血管內(nèi)快速時、動態(tài)、長時間的監(jiān)測循環(huán)系統(tǒng)中的熒光標(biāo)活體流式細(xì)胞儀的原理圖：激發(fā)光源通過光斑通過顯微鏡鏡頭聚焦在活體表淺的適當(dāng)血的靶細(xì)胞（如 CTC）通過激光在該血管的聚定波長的熒光信號，其發(fā)出的熒光信號被熒轉(zhuǎn)換器（PMT）后光信號轉(zhuǎn)換成電信號，電信得到單位時間（比如每分鐘）通過該視窗的

圖 2-3 基于熒光標(biāo)記的多波長活體流式細(xì)胞儀整體結(jié)構(gòu)原理圖A-激光激發(fā)系統(tǒng)；B-圖像導(dǎo)航系統(tǒng)；C-熒光信號接收與分析系統(tǒng)Figure 2-3 Fluorescent labeling based on the overall structure of the in vivo flow cytometeschematic；A-Laser excitation system；B-Image navigation system；C-Fluorescent signal receptiand analysis system激光激發(fā)系統(tǒng)：激發(fā)光路系統(tǒng)是為整個活體流式細(xì)胞儀提供激發(fā)光源，主要包括：488 nm 波長激光器、561 nm 波長激光器、635 nm 波長激光器，反射鏡片柱透鏡、消色差透鏡、物鏡等組成。激光激發(fā)系統(tǒng)設(shè)計(jì)工作原理為：561nm 波長激光器、488nm 激光器和 635n波長激光器分別經(jīng)反射鏡（M1）、分光鏡（M2）和分光鏡（M3）反射到同一直線上，然后經(jīng)柱透鏡（CL）將激光的圓形光斑壓縮成條形光斑，從柱透鏡出的條形光斑經(jīng)過消色差透鏡進(jìn)行消色差優(yōu)化處理，光束通過分光鏡（DM3）反射進(jìn)入物鏡，物鏡將光斑進(jìn)行聚焦，最終形成一個約為 5×100 微米的一個條形光斑該光斑可以有效覆蓋小動物（小鼠）耳部血管形成激光視窗，當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中有熒

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李延;樊志超;郭進(jìn);劉光大;譚曉英;王成;顧正勤;魏勛斌;;Circulation times of hepatocellular carcinoma cells by in vivo flow cytometry[J];Chinese Optics Letters;2010年10期

本文編號：2813469