發(fā)布時(shí)間：2020-09-03 09:41

　　 目的:腫瘤細(xì)胞在利用周圍環(huán)境增殖的同時(shí),也在改變其生長(zhǎng)的微環(huán)境,使細(xì)胞外呈現(xiàn)酸性,間質(zhì)細(xì)胞中單核-巨噬細(xì)胞受微環(huán)境的變化而影響其表型分化及功能狀態(tài),更多的參與了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究模擬腫瘤細(xì)胞外酸性微環(huán)境,了解酸性微環(huán)境下Tca8113細(xì)胞增殖及分泌細(xì)胞因子等生物學(xué)行為的變化、酸性微環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞表型分化及功能狀態(tài)的影響及雷公藤甲素(TP)在此過(guò)程中的干預(yù)效果,進(jìn)一步了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞抵御治療的機(jī)制,也為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。方法:1、通過(guò)10%HCl調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)液的p H值分別為7.2、7.0、6.8、6.6下進(jìn)行64h Tca8113細(xì)胞的培養(yǎng),ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中的白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)和低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的含量,MTS法測(cè)定Tca8113細(xì)胞增殖情況;2、流式細(xì)胞儀分離人外周血單核細(xì)胞,通過(guò)10%HCl調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)液的p H值分別為7.2、7.0、6.8、6.6,分別單獨(dú)培養(yǎng)及與Tca8113細(xì)胞混合培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間為經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的64h,流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表面CD68分子、CDl63分子和CD80分子的表達(dá)以進(jìn)行巨噬細(xì)胞分型,其中CD68分子標(biāo)記巨噬細(xì)胞,CD80標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞,CD163分子標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞;ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中的白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、白細(xì)胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的含量;上述培養(yǎng)液采用MTS法檢測(cè)對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用;不同p H值下混合培養(yǎng)MTS法測(cè)定Tca8113細(xì)胞的增殖。3、通過(guò)10%HCl調(diào)整單核-巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液的p H值分別為7.2、6.8、6.6,進(jìn)行24h、48h、72h的培養(yǎng),分別加入不同濃度TP,ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中VEGF和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(vascular endothelial growth factor,VEGF-C)的含量;4、提取人外周血單核細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)液的p H值分別為7.2、7.0、6.8、6.6,加入不同濃度的TP,培養(yǎng)64h,流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表面CD68分子、CDl63分子和CD80分子的陽(yáng)性及陰性以進(jìn)行單核-巨噬細(xì)胞分型,ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中的IL-10、IL-12的含量,收集上述培養(yǎng)液采用MTS法檢測(cè)對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用;在單核-巨噬細(xì)胞與Tca8113細(xì)胞混合培養(yǎng)液中加入上述不同濃度的TP,MTS法測(cè)定Tca8113細(xì)胞增殖情況,設(shè)Tca8113細(xì)胞加入不同濃度TP作為對(duì)照。結(jié)果:1、p H值為7.2、7.0、6.8、6.6時(shí),Tca-8113細(xì)胞OD值分別為2.722±0.039、2.828±0.048、2.884±0.010、2.896±0.022,各組間有顯著性差異(P0.05),培養(yǎng)液中IL-8含量分別為192.8±3.5、205.9±0.7、208.6±0.5、216.4±3.9ng/L,各組間有顯著性差異(P0.05),MCP-1含量分別為33.74±0.27、33.82±0.41、34.07±0.41、34.77±0.45ng/L,差異有顯著性(P0.05),HIF-1含量分別為36.63±0.11、37.78±1.05、37.71±0.74、128.90±2.97ng/L,各組間有顯著性差異(P0.05)。2、單核-巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組中,p H值為7.2、7.0、6.8、6.6時(shí),CD68+單核-巨噬細(xì)胞分別為97.65%、97.50%、97.09%、98.84%,差異沒(méi)有顯著性(P0.01);CD68+CD163+單核-巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)分別為2.61%、2.73%、2.71%、6.40%,其中p H值6.6時(shí)高于p H值7.2、7.0、6.8時(shí),差異有顯著性(P0.01);CD68+CD80+單核-巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)分別為3.77%、6.60%、5.82%、17.74%,其中p H值6.6時(shí)高于p H值7.2、7.0、6.8時(shí),差異有顯著性(P0.01);培養(yǎng)液中代表M2型巨噬細(xì)胞分泌的IL-10含量分別為37.26±0.17、37.22±0.17、38.57±1.50、39.63±0.83ng/L,差異有顯著性(P0.05);VEGF分別為103.0±1.2、102.5±0.5、106.5±2.1、110.3±4.8pg/L,差異有顯著性(P0.05);培養(yǎng)液中代表M1巨噬細(xì)胞分泌的IL-12含量分別為5.939±0.024、5.925±0.048、5.884±0.024、5.842±0.048ng/L,差異有顯著性(P0.05)。單核-巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)組中,p H值為7.2、7.0、6.8、6.6時(shí),CD68+單核-巨噬細(xì)胞分別為98.00%、95.66%、97.07%、99.37%,p H值6.6時(shí)與p H值7.0時(shí)差異有顯著性(P0.01),相同p H值時(shí)與單獨(dú)單核-巨噬細(xì)胞培養(yǎng)組差異沒(méi)有顯著性(P0.01);CD68+CD163+單核-巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)分別為1.81%、2.94%、3.46%、5.67%,其中p H值6.8時(shí)與p H值7.2、7.0時(shí)比較及p H值6.6時(shí)與其它p H值時(shí)比較,差異有顯著性(P0.01),p H6.8時(shí)其比率高于而p H6.6低于單獨(dú)單核-巨噬細(xì)胞培養(yǎng)組,差異有顯著性(P0.01);CD68+CD80+單核-巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)分別為5.88%、10.10%、10.72%、14.09%,差異有顯著性(P0.01),p H7.0、6.8時(shí)其比率高于而p H6.6低于單獨(dú)單核-巨噬細(xì)胞培養(yǎng)組,差異有顯著性(P0.01);培養(yǎng)液中代表M2型巨噬細(xì)胞分泌的IL-10含量分別為37.10±0.55、37.34±0.55、54.63±0.41、56.16±0.93ng/L,差異有顯著性差異(P0.05);VEGF分別為171.7±0.9、173.3±1.2、173.0±0.8、177.4±2.5pg/L,差異有顯著性(P0.05),培養(yǎng)液中代表M1巨噬細(xì)胞分泌的IL-12含量分別為9.703±0.080、9.730±0.023、9.556±0.129、9.490±0.122ng/L,差異有顯著性(P0.05)。3、在相同p H值時(shí)隨著TP濃度的增加THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF、VEGF-C含量減少,差異有顯著性(p0.05),p H值6.6及TP濃度50ug/ml時(shí)最低(p0.05)。4、酸性微環(huán)境下經(jīng)TP干預(yù)后,與不加TP相比,加入不同濃度TP后M1型巨噬細(xì)胞比率增加,而且隨TP濃度上升比率增加,差異有顯著性(p0.01),TP在較低濃度(10-25μg/ml)M2型巨噬細(xì)胞比率有增加,差異有顯著性(p0.01),在較高濃度50-100μg/ml時(shí)M2型巨噬細(xì)胞比率明顯減少,差異有顯著性(p0.01);析因方差分析顯示,在不同p H值下隨TP濃度的增加細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-10的含量均出現(xiàn)減少(p0.01),而IL-12含量隨TP濃度的增加均出現(xiàn)增加(p0.01),TP濃度為50μg/ml、100μg/ml時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-12較TP濃度為10μg/ml、25μg/ml時(shí)增加明顯(p0.05);不同p H值時(shí)加入不同濃度的TP的細(xì)胞培養(yǎng)液明顯增加了淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,并隨濃度的上升作用增強(qiáng)(p0.05)。單獨(dú)應(yīng)用TP在低濃度時(shí)(10μg/ml和25μg/ml)Tca8113細(xì)胞數(shù)量有增加,而在高濃度(50μg/ml和100μg/ml)時(shí)Tca8113細(xì)胞數(shù)量明顯減少(p0.05);與單核-巨噬細(xì)胞聯(lián)合加入不同濃度的TP均使Tca8113細(xì)胞數(shù)量明顯減少,且隨濃度增加而減少明顯(p0.05)。結(jié)論:1、Tca8113細(xì)胞能夠通過(guò)自身的改變更好的適應(yīng)酸性微環(huán)境,上調(diào)多種對(duì)單核-巨噬細(xì)胞具有趨化作用的因子,Tca8113細(xì)胞能夠作為研究酸性微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞及非腫瘤細(xì)胞影響的研究對(duì)象;2、酸性微環(huán)境可以使單核細(xì)胞向M1和M2型巨噬細(xì)胞兩極分化,但表現(xiàn)為M2型巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài),從而更多的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),酸性微環(huán)境可能是腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)促瘤作用的直接因素之一;3、在酸性微環(huán)境下,低濃度TP就能促使單核細(xì)胞更多的向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并表現(xiàn)為M1型巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài),產(chǎn)生明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用,TP可以作為以腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物研發(fā)的研究方向,但其機(jī)制及如何有效利用TP調(diào)節(jié)單核-巨噬細(xì)胞分化及功能狀態(tài)而達(dá)到抗腫瘤的目的還需要更多的研究。
【學(xué)位單位】：貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R730.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2811269