【摘要】：環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA),與線性RNA(linear RNA,含5’和3'端)不同,是一類呈封閉環(huán)狀的特殊內(nèi)源RNA分子,因此在細胞中不受RNA外切酶的影響,表達更穩(wěn)定且不易降解。近年相關的研究表明,circRNA分子含有microRNA(miRNA)和RNA結(jié)合蛋白(RBP)結(jié)合位點,在細胞中起到miRNA海綿和反式作用因子的作用,對疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。環(huán)狀RNA作為一類新型的內(nèi)源RNA分子,從形成的機制到生物學功能越來越受到研究者的關注。腫瘤壞死因子TNF-α是主要由脂多糖刺激巨噬細胞而產(chǎn)生、具有豐富生物活性的細胞因子,能夠與靶細胞膜上的TNFR結(jié)合,然后通過受體介導相應的信號通路將信息傳遞到胞核,促進目的基因表達進而合成蛋白質(zhì),并與其他細胞因子共同作用,激活免疫反應,導致腫瘤壞死。本研究以正常人肝細胞HL-7702,肝癌細胞HepG2和使用腫瘤壞死因子TNF-α誘導3小時的肝癌細胞HepG2_3h為實驗樣本并分為兩個實驗組,分別對其總RNA進行去rRNA鏈特異性RNA測序及small RNA表達譜測序,對測序數(shù)據(jù)利用生物信息學方法獲取mRNA、circRNA及microRNA表達譜數(shù)據(jù),對表達譜數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析,篩選出了可能與TNF-α相關的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡關系,為進一步從分子生物學實驗中尋找腫瘤發(fā)生相關的非編碼RNA及其調(diào)控關系研究提供一定的生物信息學理論依據(jù)。本課題主要分為以下三個部分:1.對HL-7702正常人肝細胞及TNF-α處理前后的HepG2肝癌細胞的全轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果從堿基質(zhì)量和堿基分布兩個方面進行了質(zhì)量評估,結(jié)果表明我們的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠,進一步的生物信息學分析可以開展。然后,對三個樣本的circRNA進行了預測,并對circRNA的表達數(shù)量,基因組不同區(qū)間的分布、mapping到基因組各個染色體的reads以及back-splicing reads以及circRNA的長度進行了統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)與之前關于人類環(huán)狀RNA相關研究的結(jié)果基本相一致,預測結(jié)果的可信度比較高。2.對TNF-α處理前后的HepG2肝癌細胞及HL-7702正常人肝細胞的circRNA進行了差異表達分析和來源基因的功能注釋,主要包括GO功能富集分析和KEGG Pathway分析。首先對三個樣本的circRNA表達水平進行了定量和歸一化,比較不同樣本間的差異表達情況,挑選出表達差異明顯的circRNA。最后對挑選出的差異明顯的circRNA來源基因進行了功能注釋和通路分析,發(fā)現(xiàn)在表達下調(diào)的circRNA中,其對應的host gene富集的GO條目與腫瘤高度相關,如細胞周期,細胞遷移等。與此同時,信號通路分析發(fā)現(xiàn)兩條與癌癥相關的信號通路:hsa04120:Ubiquitin mediated proteolysis,hsa04012:ErbB signaling pathway。研究發(fā)現(xiàn),TNF-α處理后,很多與細胞代謝凋亡相關的基因轉(zhuǎn)錄出的circRNA的表達量有明顯的變化,說明TNF-α可能誘導細胞凋亡的途徑可能與circRNA有關。3.對正常人肝細胞HL-7702,肝癌細胞HepG2及TNF-α誘導3小時的HepG2細胞的circRNA,miRNA和mRNA的表達譜關聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)17個在三個樣本中表達變化非常明顯的circRNA,通過對這17個circRNA對應的相互調(diào)控miRNA的kegg通路分析,我們發(fā)現(xiàn)有3個miRNA對應的10個靶標基因富集在與TNF-α關聯(lián)密切的NF-kappa B通路中。結(jié)合mRNA表達譜數(shù)據(jù),我們預測肝細胞癌變后,hsa_circ_0112428,hsa_circ_0004027,hsa_circ_0107593,hsa_circ_0005524,hsa_circ_0003511,hsa_circ_0008077這6個circRNAs的表達量下降,細胞中表達出的hsa-miR-3911與TNFSF14轉(zhuǎn)錄出的mRNA結(jié)合,從而負向調(diào)控TNFSF14蛋白的表達。當肝癌細胞經(jīng)過TNF-α處理后,6個circRNAs的表達量上升,它們可以作為像海綿一樣競爭性結(jié)合hsa-miR-3911,使其不能與TNFSF14轉(zhuǎn)錄出的mRNA結(jié)合,從而正向調(diào)控TNFSF14蛋白的表達,誘導腫瘤細胞凋亡。
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7;Q811.4
【圖文】：

再切除內(nèi)含子后形成 circRNA（如圖1-1 A 所示）；而內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化主要是通過環(huán)化 RNA 兩側(cè)內(nèi)含子區(qū)的ALU 重復序列( 即限制性內(nèi)切核酸酶 AluⅠ的識別序列 AGCT) ，或其它 RNA二級結(jié)構(gòu)，使兩個內(nèi)含子通過堿基互補配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)后再切除內(nèi)含子從而形成環(huán)狀 RNA( 如圖 1-1 B 所示)[15]。也有科學家研究發(fā)現(xiàn)一種現(xiàn)象叫做可變環(huán)化

圖 1-2 轉(zhuǎn)錄組測序流程究內(nèi)容肝癌細胞株 HepG2 在基因?qū)W及毒理學等研究中被廣泛應用，對研發(fā)展機制及臨床治療有著非常重要的幫助。本課題選擇正常人2，肝癌細胞 HepG2 和腫瘤壞死因子 TNF-α 誘導 3h 的肝癌細胞 H樣本并分為兩個實驗組，利用 IlluminaHiseq2000 測序平臺分別對NA 去 rRNA 后進行全轉(zhuǎn)錄組測序，采用生物信息學方法獲得其數(shù)據(jù)，探索 TNF-α 對肝癌細胞中 circRNA 表達的影響；并結(jié)合項三個樣本的 miRNA/mRNA 表達譜數(shù)據(jù)，對三者進行表達譜關聯(lián)F-α 作用于的 circRNA、miRNA、mRNA 之間相互作用網(wǎng)絡的初步結(jié)構(gòu)如下：

15圖 2-1 轉(zhuǎn)錄組測序（鏈特異）建庫原理備的主要實驗步驟如下：洗滌——磁珠需要在室溫下使用，而且在使用之前必須保持試劑為：RNase-Free 水 225μl；磁珠 225μl，磁珠懸浮液 65試管，RiboGuard RNaseRiboGuard RNase Inhibitor1 μl。2°C 至 8°C 保存 Magnetic Core Kit 各組分，取出后，Magneti放置在冰上，要將其恢復至室溫。Magnetic Beads 進行劇烈震蕩保證其混勻充分。

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本文編號：2805203