【摘要】：環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA),與線性RNA(linear RNA,含5’和3'端)不同,是一類呈封閉環(huán)狀的特殊內(nèi)源RNA分子,因此在細(xì)胞中不受RNA外切酶的影響,表達(dá)更穩(wěn)定且不易降解。近年相關(guān)的研究表明,circRNA分子含有microRNA(miRNA)和RNA結(jié)合蛋白(RBP)結(jié)合位點(diǎn),在細(xì)胞中起到miRNA海綿和反式作用因子的作用,對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。環(huán)狀RNA作為一類新型的內(nèi)源RNA分子,從形成的機(jī)制到生物學(xué)功能越來越受到研究者的關(guān)注。腫瘤壞死因子TNF-α是主要由脂多糖刺激巨噬細(xì)胞而產(chǎn)生、具有豐富生物活性的細(xì)胞因子,能夠與靶細(xì)胞膜上的TNFR結(jié)合,然后通過受體介導(dǎo)相應(yīng)的信號(hào)通路將信息傳遞到胞核,促進(jìn)目的基因表達(dá)進(jìn)而合成蛋白質(zhì),并與其他細(xì)胞因子共同作用,激活免疫反應(yīng),導(dǎo)致腫瘤壞死。本研究以正常人肝細(xì)胞HL-7702,肝癌細(xì)胞HepG2和使用腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)3小時(shí)的肝癌細(xì)胞HepG2_3h為實(shí)驗(yàn)樣本并分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組,分別對(duì)其總RNA進(jìn)行去rRNA鏈特異性RNA測(cè)序及small RNA表達(dá)譜測(cè)序,對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)利用生物信息學(xué)方法獲取mRNA、circRNA及microRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù),對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,篩選出了可能與TNF-α相關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,為進(jìn)一步從分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中尋找腫瘤發(fā)生相關(guān)的非編碼RNA及其調(diào)控關(guān)系研究提供一定的生物信息學(xué)理論依據(jù)。本課題主要分為以下三個(gè)部分:1.對(duì)HL-7702正常人肝細(xì)胞及TNF-α處理前后的HepG2肝癌細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果從堿基質(zhì)量和堿基分布兩個(gè)方面進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)估,結(jié)果表明我們的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠,進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析可以開展。然后,對(duì)三個(gè)樣本的circRNA進(jìn)行了預(yù)測(cè),并對(duì)circRNA的表達(dá)數(shù)量,基因組不同區(qū)間的分布、mapping到基因組各個(gè)染色體的reads以及back-splicing reads以及circRNA的長(zhǎng)度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)與之前關(guān)于人類環(huán)狀RNA相關(guān)研究的結(jié)果基本相一致,預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度比較高。2.對(duì)TNF-α處理前后的HepG2肝癌細(xì)胞及HL-7702正常人肝細(xì)胞的circRNA進(jìn)行了差異表達(dá)分析和來源基因的功能注釋,主要包括GO功能富集分析和KEGG Pathway分析。首先對(duì)三個(gè)樣本的circRNA表達(dá)水平進(jìn)行了定量和歸一化,比較不同樣本間的差異表達(dá)情況,挑選出表達(dá)差異明顯的circRNA。最后對(duì)挑選出的差異明顯的circRNA來源基因進(jìn)行了功能注釋和通路分析,發(fā)現(xiàn)在表達(dá)下調(diào)的circRNA中,其對(duì)應(yīng)的host gene富集的GO條目與腫瘤高度相關(guān),如細(xì)胞周期,細(xì)胞遷移等。與此同時(shí),信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)兩條與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路:hsa04120:Ubiquitin mediated proteolysis,hsa04012:ErbB signaling pathway。研究發(fā)現(xiàn),TNF-α處理后,很多與細(xì)胞代謝凋亡相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄出的circRNA的表達(dá)量有明顯的變化,說明TNF-α可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑可能與circRNA有關(guān)。3.對(duì)正常人肝細(xì)胞HL-7702,肝癌細(xì)胞HepG2及TNF-α誘導(dǎo)3小時(shí)的HepG2細(xì)胞的circRNA,miRNA和mRNA的表達(dá)譜關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)17個(gè)在三個(gè)樣本中表達(dá)變化非常明顯的circRNA,通過對(duì)這17個(gè)circRNA對(duì)應(yīng)的相互調(diào)控miRNA的kegg通路分析,我們發(fā)現(xiàn)有3個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的10個(gè)靶標(biāo)基因富集在與TNF-α關(guān)聯(lián)密切的NF-kappa B通路中。結(jié)合mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù),我們預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌變后,hsa_circ_0112428,hsa_circ_0004027,hsa_circ_0107593,hsa_circ_0005524,hsa_circ_0003511,hsa_circ_0008077這6個(gè)circRNAs的表達(dá)量下降,細(xì)胞中表達(dá)出的hsa-miR-3911與TNFSF14轉(zhuǎn)錄出的mRNA結(jié)合,從而負(fù)向調(diào)控TNFSF14蛋白的表達(dá)。當(dāng)肝癌細(xì)胞經(jīng)過TNF-α處理后,6個(gè)circRNAs的表達(dá)量上升,它們可以作為像海綿一樣競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hsa-miR-3911,使其不能與TNFSF14轉(zhuǎn)錄出的mRNA結(jié)合,從而正向調(diào)控TNFSF14蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7;Q811.4
【圖文】：

再切除內(nèi)含子后形成 circRNA（如圖1-1 A 所示）；而內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)的環(huán)化主要是通過環(huán)化 RNA 兩側(cè)內(nèi)含子區(qū)的ALU 重復(fù)序列( 即限制性內(nèi)切核酸酶 AluⅠ的識(shí)別序列 AGCT) ，或其它 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，使兩個(gè)內(nèi)含子通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)后再切除內(nèi)含子從而形成環(huán)狀 RNA( 如圖 1-1 B 所示)[15]。也有科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)一種現(xiàn)象叫做可變環(huán)化

圖 1-2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程究?jī)?nèi)容肝癌細(xì)胞株 HepG2 在基因?qū)W及毒理學(xué)等研究中被廣泛應(yīng)用，對(duì)研發(fā)展機(jī)制及臨床治療有著非常重要的幫助。本課題選擇正常人2，肝癌細(xì)胞 HepG2 和腫瘤壞死因子 TNF-α 誘導(dǎo) 3h 的肝癌細(xì)胞 H樣本并分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，利用 IlluminaHiseq2000 測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)NA 去 rRNA 后進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采用生物信息學(xué)方法獲得其數(shù)據(jù)，探索 TNF-α 對(duì)肝癌細(xì)胞中 circRNA 表達(dá)的影響；并結(jié)合項(xiàng)三個(gè)樣本的 miRNA/mRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)三者進(jìn)行表達(dá)譜關(guān)聯(lián)F-α 作用于的 circRNA、miRNA、mRNA 之間相互作用網(wǎng)絡(luò)的初步結(jié)構(gòu)如下：

15圖 2-1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（鏈特異）建庫(kù)原理備的主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：洗滌——磁珠需要在室溫下使用，而且在使用之前必須保持試劑為：RNase-Free 水 225μl；磁珠 225μl，磁珠懸浮液 65試管，RiboGuard RNaseRiboGuard RNase Inhibitor1 μl。2°C 至 8°C 保存 Magnetic Core Kit 各組分，取出后，Magneti放置在冰上，要將其恢復(fù)至室溫。Magnetic Beads 進(jìn)行劇烈震蕩保證其混勻充分。

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本文編號(hào)：2805203