【摘要】：研究背景：胃癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一,隨著生活方式和飲食習慣的改變,我國胃癌的發(fā)病率急劇上升。盡管近年來胃鏡技術(shù)的發(fā)展使得胃癌的早期診斷率得以提高,手術(shù)方式和藥物治療的進步,使得早期胃癌患者的生存率大大改善,但進展期胃癌患者的預后仍然較差,死亡率仍居高不下。目前胃癌發(fā)生、發(fā)展機制尚不清楚,胃癌癌變過程是多階段、多基因參與的復雜過程,尋找和鑒定胃癌相關(guān)標志物,探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制,為早期診斷和干預、治療提供分子靶點,成為胃癌研究的重要內(nèi)容,更為臨床研究提供理論依據(jù)。我們前期在對N.cadherin(神經(jīng)鈣黏蛋白)與胃癌發(fā)展關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)catenin家族的成員之一catenin.δ1(CTNND1)與cadherin家族成員的關(guān)系比較密切,兩者結(jié)合形成的cadherin-catenin復合物在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中起著重要的作用。CTNND1主要是與E-cadherin(上皮粘附素)的跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)合,定位于細胞膜的內(nèi)側(cè),維持細胞極性的穩(wěn)定。當E-cadherin缺失時,CTNND1大部分游離于細胞漿,漿定位的CTNND1連同N-cadherin結(jié)合一小部分CTNND1一起,一方面抑制RhoA(Ras homolog gene family,member A)GTPase的活性,另一方面激活Rac 1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)和Cdc42(cell division cycle 42),共同促進遷移和浸潤的發(fā)生,提示CTNND1可能為腫瘤相關(guān)基因。Castillo等在非小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)CTNND1基因存在大量的擴增,而另有文獻報道其在結(jié)腸癌和乳腺癌中的表達呈下調(diào)趨勢,這說明CTNND1在不同腫瘤中的表達情況不同,提示其在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也可能不盡相同。Liu和Mann等研究還發(fā)現(xiàn)漿定位的CTNND1 與肺癌和胰腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān),提示CTNND1在促癌中的作用機制可能與其定位有關(guān)。目前CTNND1與胃癌關(guān)系的研究未見報道,胃癌中是否存在CTNND1的異常表達和定位的改變,以及CTNND1的表達和定位與胃癌發(fā)生和發(fā)展之間是否存在聯(lián)系等問題仍有待于進一步探索。microRNA (miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非編碼的單鏈RNA分子,雖然其序列只有短短18-22個核苷酸,但其調(diào)控功能卻異常強大。有研究表明,約650種人類niRNAs調(diào)控的靶基因占據(jù)了人類基因組的三分之一,且大多數(shù)信號轉(zhuǎn)導通路都有miRNAs的參與,據(jù)報道超過50%的miRNAs被發(fā)現(xiàn)定位于與人類腫瘤相關(guān)的染色體上。miRNAs通過種子序列(其中的6-8個核苷酸),與靶基因的3’非編碼區(qū)結(jié)合參與降解靶基因mRNA或抑制靶蛋白的翻譯,從而參與調(diào)節(jié)人體的多種生理(包括細胞的生長、增殖、分化和凋亡等)和病理(腫瘤細胞的生長、增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移等)過程。我們推測CTNND1也可能受到miRNA的調(diào)控,進而影響其生物學功能。通過檢索Targetscan, PicTar, miRanda預測軟件,我們發(fā)現(xiàn)CTNND1的3'-UTR區(qū)可以與miR-145, miR-197, miR-96, miR-143的種子序列匹配。通過熒光素酶實驗的檢測,我們發(fā)現(xiàn)miR-145轉(zhuǎn)染組熒光活性下降最明顯,提示CTNND1受miR-145調(diào)控的可能性較大。本研究中我們將進一步驗證miR-145能否調(diào)控CTNND1的表達及其定位,研究CTNND1與cadherin家族成員的作用關(guān)系,并深入探討其調(diào)控的分子機制。此外,我們還將構(gòu)建裸鼠成瘤模型,在體內(nèi)進一步驗證CTNND1的表達及定位與胃癌浸潤的關(guān)系。研究方法：1.本研究對126例臨床胃癌標本和50例非腫瘤胃黏膜組織進行免疫組化方法檢測CTNND1的表達和觀察其細胞定位情況,并進一步分析其表達和定位與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。2.利用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線,采用Log-rank檢驗對兩組胃癌患者(陰性與陽性,膜定位與漿定位)的總體生存率和無瘤生存率進行統(tǒng)計分析,探討CTNND1的表達及其定位與胃癌患者生存率的關(guān)系。3.通過Cox比例風險回歸模型單因素和多因素統(tǒng)計分析,進一步驗證CTNND1漿定位能否作為預測胃癌患者預后的獨立危險因素。4.構(gòu)建CTNND1過表達和siRNA質(zhì)粒,將CTNND1 cDNA和CTNND1 siRNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞,使CTNND1的表達上調(diào)和下調(diào),然后驗證其生物學功能。通過Transwell小室,MTS實驗,流式細胞技術(shù)檢測CTNND1的表達對細胞遷移和浸潤能力、增殖和凋亡作用的影響。5.實時定量PCR檢測胃癌組織中miR-145的表達情況,評估m(xù)iR-145與總體CTNND1的陽性表達率是否存在相關(guān)性。同時擴增CTNND13 '-UTR區(qū)序列,構(gòu)建pmirGLO熒光素酶載體,通過雙熒光報告系統(tǒng)檢測和western blot分析驗證CTNND1是否受到miR-145的調(diào)控。6.對臨床樣本中miR-145與膜定位和漿定位的CTNND1的陽性表達率分別進行相關(guān)性分析,驗證miR-145對CTNND1定位是否具有調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)染miR-145和miR-control,通過細胞免疫熒光技術(shù)和western blot實驗,觀察CTNND1, E-cadherin 和 N-cadherin的表達及細胞定位的情況。進行N-cadherin siRNA轉(zhuǎn)染,利用細胞免疫熒光技術(shù)和western blot實驗探討N-cadherin 在 miR-145調(diào)控CTNND1表達和定位中的作用,進一步闡明miR-145調(diào)控CTNND1漿定位抑制胃癌浸潤的分子機制。7.將轉(zhuǎn)染慢病毒表達載體pEZX-miR-145及pEZX-miR-control的腫瘤細胞注射到裸鼠體內(nèi),構(gòu)建成瘤模型。6周后取出裸鼠中瘤體組織,測量兩組裸鼠瘤體組織的直徑,并對瘤體切片進行HE和CTNND1免疫組化染色,觀察兩組腫瘤組織浸潤和CTNND1定位的情況,體內(nèi)進一步驗證CTNIMD1定位與胃癌浸潤的關(guān)系。結(jié)果：1.免疫組化結(jié)果顯示：在非腫瘤胃黏膜組織中,CTNND1定位于細胞膜。相比非腫瘤胃黏膜組織,CTNND1在胃癌組織中表達上調(diào)。CTNND1在胃癌組織中的表達有細胞膜和細胞漿兩種定位形式,尤以漿定位居多。CTNND1的總體陽性表達只與胃癌的分化程度和Lauren分型相關(guān),與其它臨床病理參數(shù)無密切聯(lián)系。而漿表達的CTNND與胃癌的臨床分期、T分期、淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移及Lauren分型情況密切相關(guān)。2. Kaplan-Meier生存曲線顯示胃癌患者的總體生存時間和無瘤生存時間與CTNND1的定位密切有關(guān),而與CTNND1的總體表達情況無關(guān)。CTNND1漿定位的腫瘤患者生存期更短,預后更差。3.通過Cox回歸模型單因素統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)漿定位CTNND1, UICC臨床分期,T分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移都是影響胃癌患者預后的危險因素。多因素統(tǒng)計分析表明漿定位CTNND1是預測胃癌患者預后的獨立危險因素。4. CTNND1 cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后與Mock control組相比,胃癌細胞SGC7901的遷移和浸潤顯著增加,同時CTNND1 siRNA轉(zhuǎn)染后SGC7901的遷移和浸潤能力又明顯下降。MTS實驗和流式細胞檢測結(jié)果顯示CTNND1的表達下調(diào)后對胃癌細胞的增殖和凋亡沒有顯著的作用。5.本研究結(jié)果顯示miR-145的表達與CTNND1的陽性表達率存在負相關(guān)。熒光素酶實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145 和 CTNND1-pmirGLO載體共轉(zhuǎn)染組細胞的熒光強度明顯低于對照組。轉(zhuǎn)染miR-145后,western blot實驗結(jié)果顯示CTNND1蛋白表達明顯下調(diào)。以上結(jié)果均提示CTNND1是miR-145調(diào)控的直接靶基因。6.相關(guān)性分析顯示miR-145的表達與漿定位CTNND1的表達存在顯著的負相關(guān),提示miR-145可能參與了CTNND1定位的調(diào)節(jié)。細胞免疫熒光實驗顯示：miR-control轉(zhuǎn)染組的細胞CTNND1主要定位于細胞漿,而miR-145轉(zhuǎn)染組細胞CTNND1定位于細胞膜上。本研究進一步表明miR-145介導了CTNND1由細胞漿向細胞膜定位的改變。隨后我們又檢測了N-cadherin 和 E-cadherin的定位情況,發(fā)現(xiàn)與miR-control組相比,miR-145轉(zhuǎn)染組細胞N-cadherin蛋白表達有所降低(熒光強度降低但定位沒有改變),同時E-cadherin的定位也由細胞漿轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎ど�。為進一步判斷N-cadherin 在 CTNND1 和 E-cadherin的定位改變的作用,我們將N-cadherin siRNA轉(zhuǎn)染的細胞進行免疫熒光實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,N-cadherin siRNA轉(zhuǎn)染組的細胞CTNND1口E-cadherin的表達也出現(xiàn)了膜定位的改變,這說明miR-145介導的CTNND1和E-cadherin定位的改變是通過N-cadherin的表達來實現(xiàn)的。Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-145 和 N-cadherin siRNA 后, CTNND1總蛋白表達下調(diào),CTNND1膜蛋白表達卻增加,而E-cadherin蛋白的表達量沒有改變。7.動物實驗結(jié)果表明pEZX-miR-145 及 pEZX-miR-control兩組瘤體的大小沒有顯著差異。pEZX-miR-145組瘤體包膜完整,沒有出現(xiàn)肌肉浸潤的現(xiàn)象,免疫組化結(jié)果顯示CTNND1主要定位于細胞膜。而pEZX-miR-control組瘤體包膜不完整,出現(xiàn)了肌肉和血管浸潤的現(xiàn)象,其中CTNND1主要定位于細胞漿。Western blot檢測結(jié)果顯示pEZX-miR-145組CTNND1蛋白的表達明顯低于pEZX-miR-control對照組。結(jié)論：1. CTNND1在胃癌組織中高表達,且主要定位于細胞漿。CTNND1的漿定位與胃癌的臨床分期、T分期、淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移及Lauren分型情況密切相關(guān)。2.相比CTNND1膜定位的胃癌患者,漿定位的胃癌患者生存時間更短,預后更差。漿定位CTNND1可以作為預測胃癌患者預后的獨立影響因子。3.漿定位的CTNND1表達上調(diào)可以增強胃癌細胞遷移和浸潤能力,但對細胞的增殖和凋亡無明顯作用。CTNND1有望成為胃癌治療的靶點。4. CTNND1的表達及定位受到miR-145的調(diào)控。CTNND1表達上調(diào)的原因在于miR-145表達的下調(diào),CTNND1是miR-145的直接靶基因,miR-145不僅能下調(diào)漿定位CTNND1的表達,而且還可以介導CTNND1由細胞漿向細胞膜定位的改變。5.miR-145一方面可以通過直接下調(diào)CTNND1的漿表達發(fā)揮抑癌作用,另一方面又通過下調(diào)N-cadherin蛋白的表達間接恢復CTNND1和E-cadherin的膜定位,從而起到抑制胃癌浸潤的作用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

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1 Xiao-Li Wu;Bin Cheng;Pei-Yuan Li;Huan-Jun Huang;Qiu Zhao;Zi-Li Dan;Dean Tian;Peng Zhang;;MicroRNA-143 suppresses gastric cancer cell growth and induces apoptosis by targeting COX-2[J];World Journal of Gastroenterology;2013年43期

本文編號：2798583