【摘要】：目的:癌癥惡病質(zhì)是由多種因素相互作用所導(dǎo)致的一種重要的疾病綜合征,主要表現(xiàn)為進行性的骨骼肌萎縮,嚴(yán)重影響惡性腫瘤患者的生活質(zhì)量及預(yù)后。癌癥惡病質(zhì)的骨骼肌萎縮是多種機制共同作用造成的結(jié)果,這些機制包括骨骼肌細(xì)胞蛋白代謝失衡、骨骼肌細(xì)胞損傷以及骨骼肌再生障礙等。目前尚無有效的臨床治療方法用于緩解癌癥惡病質(zhì)的肌肉萎縮。Ghrelin為具有多種生物學(xué)活性的小分子多肽,辛�；痝hrelin(AG)和非辛�；痝hrelin(UnAG)均可以緩解多種疾病導(dǎo)致的骨骼肌萎縮,但其能否治療癌癥惡病質(zhì)的骨骼肌萎縮卻鮮有報道,具體作用機制也尚不明確,值得進一步研究。本研究通過體外細(xì)胞共培養(yǎng)模型和癌癥惡病質(zhì)小鼠模型探討:(1)Ghrelin對共培養(yǎng)環(huán)境下肌管細(xì)胞萎縮的影響及其機制;(2)Ghrelin對共培養(yǎng)環(huán)境下成肌細(xì)胞凋亡的影響及其機制;(3)Ghrelin對癌癥惡病質(zhì)小鼠骨骼肌消耗的治療作用及其機制。本研究為進一步明確ghrelin對癌癥惡病質(zhì)骨骼肌萎縮的治療機制及其臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。方法:第一部分:小鼠C2C12成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肌管細(xì)胞并鑒定;肌管細(xì)胞與CT26細(xì)胞共培養(yǎng),觀察不同共培養(yǎng)時間對肌管細(xì)胞肌蛋白代謝的影響;將不同濃度的AG或UnAG分別作用于肌管細(xì)胞和CT26細(xì)胞,觀察其對細(xì)胞活性和增殖的影響;將不同濃度的AG或UnAG作用于共培養(yǎng)的肌管細(xì)胞24小時,觀察其對肌管細(xì)胞肌蛋白代謝的影響;將AG或UnAG作用于正�；蚬才囵B(yǎng)的肌管細(xì)胞,檢測其對肌蛋白代謝調(diào)節(jié)因子的表達(dá)和活性以及培養(yǎng)基中促炎因子和myostatin含量的影響。第二部分:C2C12成肌細(xì)胞與CT26細(xì)胞共培養(yǎng),觀察不同共培養(yǎng)時間對成肌細(xì)胞凋亡的影響;將不同濃度的AG或UnAG作用于共培養(yǎng)的成肌細(xì)胞24小時,觀察其對成肌細(xì)胞凋亡的影響;將AG或UnAG作用于正�；蚬才囵B(yǎng)的成肌細(xì)胞,檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體功能以及凋亡途徑相關(guān)蛋白和凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性,并且通過使用SP600125和LY294002這兩個信號通路抑制劑,進一步明確這些調(diào)控機制的參與。第三部分:將CT26細(xì)胞接種于雄性BALB/c小鼠背部皮下成瘤,構(gòu)建癌癥惡病質(zhì)小鼠模型,觀察AG或UnAG的干預(yù)對癌癥惡病質(zhì)小鼠骨骼肌萎縮、血清生化指標(biāo)和促炎因子含量的影響,并檢測其對骨骼肌內(nèi)肌蛋白代謝調(diào)節(jié)因子的表達(dá)和活性的影響。結(jié)果:第一部分:(1)共培養(yǎng)可以引起明顯的肌管細(xì)胞萎縮和MHC含量減少,AG及UnAG的干預(yù)可以緩解這些變化。(2)AG及UnAG作用于共培養(yǎng)的肌管細(xì)胞后可以抑制細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶、NF-κB及FoxO3a的過度激活,上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Akt活性,減少atrogin-1和MuRF1的表達(dá),并降低細(xì)胞內(nèi)的自噬水平。(3)AG及UnAG可以減少共培養(yǎng)的肌管細(xì)胞內(nèi)TNF-α和myostatin的表達(dá)和分泌,從而減少培養(yǎng)基內(nèi)TNF-α和myostatin的含量。第二部分:(1)共培養(yǎng)可以引起成肌細(xì)胞線粒體膜電位喪失和線粒體蛋白釋放,引起成肌細(xì)胞內(nèi)caspase-3片段、PARP片段以及核小體碎片的增加,并且增加成肌細(xì)胞凋亡率,AG及UnAG的干預(yù)可以緩解這些變化。(2)共培養(yǎng)可以引起成肌細(xì)胞內(nèi)JNK的激活并且抑制Akt的活性,從而增加胞質(zhì)內(nèi)tBid含量和線粒體上Bax的含量,并且減少線粒體上Bcl-2含量,AG及UnAG可以在一定程度上抑制這些變化。第三部分:(1)AG及UnAG增加荷瘤小鼠肌組織和脂肪組織的重量以及肌纖維的橫截面積,抑制荷瘤小鼠腓腸肌內(nèi)鈣蛋白酶系統(tǒng)的異常激活、游離肌絲的產(chǎn)生以及atrogin-1的表達(dá)。(2)AG及UnAG增加荷瘤小鼠腓腸肌內(nèi)Akt活性,并且減少FoxO3a的表達(dá)和活性。(3)與正常組相比,惡病質(zhì)小鼠血清總蛋白和白蛋白含量下降,血糖降低,血清甘油三酯含量升高,AG及UnAG的干預(yù)可以緩解這些改變。(4)惡病質(zhì)小鼠血清TNF-α和IL-1β含量明顯高于正常組,AG及UnAG能不同程度地逆轉(zhuǎn)這些改變。結(jié)論:(1)本研究第一部分采用的共培養(yǎng)模型可以誘導(dǎo)肌管細(xì)胞萎縮和肌蛋白代謝異常,可以在一定程度上模擬癌癥惡病質(zhì)下肌纖維的體內(nèi)環(huán)境。(2)共培養(yǎng)體系內(nèi)的CT26細(xì)胞和肌管細(xì)胞可以通過各自分泌的細(xì)胞因子相互作用,這些因子通過影響多個調(diào)控肌蛋白代謝的通路而引起肌管細(xì)胞萎縮。AG及UnAG通過抑制鈣蛋白酶活性而影響這些肌蛋白代謝調(diào)節(jié)通路,從而在促進肌蛋白合成的同時也抑制肌蛋白分解,緩解共培養(yǎng)引起的肌管細(xì)胞萎縮,表明AG及UnAG具有治療癌癥惡病質(zhì)骨骼肌肌蛋白代謝失衡的潛能。(3)本研究第二部分采用的共培養(yǎng)模型可以誘導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡,可以在一定程度上模擬癌癥惡病質(zhì)下成肌細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境。(4)共培養(yǎng)可以引起成肌細(xì)胞內(nèi)JNK的激活并且抑制Akt的活性,從而影響B(tài)cl-2蛋白家族并激活線粒體凋亡途徑,引起細(xì)胞凋亡。AG及UnAG可以抑制JNK的活性和再激活A(yù)kt,從而抑制線粒體凋亡途徑的激活,減少共培養(yǎng)的成肌細(xì)胞的凋亡,表明AG及UnAG具有治療癌癥惡病質(zhì)骨骼肌再生障礙的潛能。(5)AG及UnAG可以抑制荷瘤小鼠骨骼肌內(nèi)鈣蛋白酶系統(tǒng)的激活,從而減少肌原纖維分解。通過抑制鈣蛋白酶系統(tǒng)的激活,AG及UnAG可以增加荷瘤小鼠骨骼肌內(nèi)Akt的活性,從而抑制FoxO3a的活性,下調(diào)atrogin-1的表達(dá),減少肌蛋白降解,抑制骨骼肌萎縮。AG及UnAG還可以改善癌癥惡病質(zhì)小鼠的營養(yǎng)物質(zhì)代謝,并且減少血清促炎因子含量,從多個方面對癌癥惡病質(zhì)起到治療作用。我們的研究表明AG及UnAG有望成為治療癌癥惡病質(zhì)的新方法。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730
【圖文】：

實驗結(jié)果1.成肌細(xì)胞向肌管細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及鑒定C2C12 為 Yaffe[15]等人于 1977 年首先建立的小鼠成肌細(xì)胞株，其在完全培養(yǎng)基中可以不斷進行分裂增殖，而在分化培養(yǎng)基中單核的星形成肌細(xì)胞可以分化并相互融合成為多核的長條形肌管細(xì)胞。分化過程中，細(xì)胞持續(xù)表達(dá)生肌分化因子 D（MyoD）和肌細(xì)胞生成素（myogenin）等促肌合成因子并且合成肌球蛋白（myosin）等肌蛋白[16, 17]。實驗中通過對細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白重鏈（MHC）進行細(xì)胞免疫熒光檢測，我們觀察到，成肌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)多核長條形細(xì)胞，且該細(xì)胞 MHC 檢測陽性（如圖 1A 所示）。同時，WB結(jié)果表明，誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞高表達(dá) MyoD、myogenin 及 MHC（如圖 1B 所示）。以上實驗結(jié)果表明，經(jīng)誘導(dǎo)分化后，成肌細(xì)胞已成功分化成為肌管細(xì)胞。

圖 2. 不同共培養(yǎng)時間對肌管細(xì)胞直徑和肌蛋白代謝的影響。（A）肌管細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果。放大倍率為 100 倍，標(biāo)尺為 100μm。（B）肌管細(xì)胞直徑分析。各組肌管細(xì)胞的直徑都標(biāo)準(zhǔn)化至 NC 組的均值。（C）肌管細(xì)胞內(nèi) MHC 的蛋白含量。（D）MHC 蛋白含量的灰度分析。各組 MHC 蛋白的灰度值均標(biāo)準(zhǔn)化至相應(yīng)的 NC 組的均值。（*P < 0.05, **P <0.01, ***P < 0.001）3. 不同濃度的 AG 或 UnAG 對共培養(yǎng)環(huán)境下肌管細(xì)胞直徑和肌蛋白代謝的影響在選擇作用于細(xì)胞的 AG 或 UnAG 濃度時，我們主要參考既往文獻(xiàn)報道的10nM 和 100nM[18-21]，同時我們也檢測更低（1nM）和更高（1uM）的藥物濃度。在細(xì)胞毒性實驗中，這 4 種濃度的 AG 或 UnAG 均未表現(xiàn)出對肌管細(xì)胞的細(xì)胞毒性（如圖 3 所示）。將不同濃度的 AG 或 UnAG 作用于共培養(yǎng)的肌管細(xì)胞 24h 后，我們發(fā)現(xiàn)，10nM、100nM 和 1uM 的 AG 或 UnAG 可緩解共培養(yǎng)導(dǎo)致的肌管細(xì)胞萎縮，且 100nM 藥物濃度的效果強于 10nM，但 1uM 和 100nM 的作用效果無明顯差異，而 1nM 的藥物濃度未表現(xiàn)出緩解效果（如圖 4A、4B 所示）。這一結(jié)果

圖 3. 不同濃度的 AG 及 UnAG 對正常肌管細(xì)胞活性的影響。CCK8 法測定藥物濃度梯度增加的 AG 或 UnAG 干預(yù)后肌管細(xì)胞的活性，各組之間無顯著差異（P > 0.05）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 徐力;鹿競文;;癌癥惡病質(zhì)中醫(yī)診治體會[J];中醫(yī)臨床研究;2012年23期

2 趙艷鳳;姜達(dá);;癌性惡病質(zhì)發(fā)生的分子機制及其逆轉(zhuǎn)[J];實用腫瘤學(xué)雜志;2007年02期

本文編號：2793400