發(fā)布時(shí)間：2020-08-14 12:55

【摘要】：結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一。2015年我國惡性腫瘤數(shù)據(jù)顯示,結(jié)直腸癌的發(fā)病率位列第4,死亡率位列第5,且呈上升態(tài)勢,嚴(yán)重威脅我國公民身心健康。結(jié)直腸癌的發(fā)病受多個(gè)基因及多條信號(hào)通路的影響。因此,深入探討結(jié)直腸癌相關(guān)生長、增殖、轉(zhuǎn)移等分子機(jī)制,有利于幫助尋找潛在的生物治療靶點(diǎn)。miRNA作為具有調(diào)控作用的單鏈RNA小分子,是近年來結(jié)直腸癌研究的熱點(diǎn),大量研究顯示其在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。研究顯示,miR-335在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。然而,目前miR-335的研究主要集中于miR-335-5p,miR-335-3p的研究相對(duì)較少,且在結(jié)直腸癌中的研究尚無報(bào)道,作為成熟miR-335形成過程中的另一條重要的單鏈RNA,miR-335-3p在結(jié)直腸癌中的具體表達(dá)情況以及其在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的功能尚不清楚。因此,我們將miR-335-3p列為潛在參與結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的調(diào)控因子,開展深入的研究工作。方法:1 miR-335-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況利用采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)方法檢測miR-335-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況。2 miR-335-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響1)體外細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn):利用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞周期檢測、流式細(xì)胞凋亡檢測等方法檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HT-29轉(zhuǎn)染miR-335-3p mimics和inhibitors后細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。2)體內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn):通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建miR-335-3p穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株,將構(gòu)建成功的細(xì)胞株注射到裸鼠皮下,構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型,觀察miR-335-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)增殖能力的影響。并利用免疫組化技術(shù)檢測裸鼠皮下種植瘤中Ki67的表達(dá)情況。3 miR-335-3p下游靶基因的預(yù)測及確認(rèn)利用在線數(shù)據(jù)庫和DAVID通路富集分析預(yù)測和篩選靶基因,運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因。4 APPL1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響構(gòu)建APPL1過表達(dá)質(zhì)粒,利用細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞過表達(dá)APPL1后細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。5 miR-335-3p靶向調(diào)控APPL1促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與遷移機(jī)制運(yùn)用DAVID生物信息學(xué)分析技術(shù),結(jié)合Western blot技術(shù)檢測過表達(dá)或抑制miR-335-3p后結(jié)直腸癌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的變化情況。結(jié)果:1 miR-335-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)上調(diào)。86對(duì)配對(duì)結(jié)直腸癌組織q-PCR檢測及TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示:miR-335-3p在結(jié)直腸癌組中的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P0.01)。2 miR-335-3p的表達(dá)上調(diào)可能與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān),可能是結(jié)直腸癌患者病情評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)。對(duì)86對(duì)結(jié)直腸癌患者臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,X 2檢驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-335-3p的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)及AJCC分期(P=0.003)密切相關(guān),提示miR-335-3p的表達(dá)上調(diào)可能與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān),可能是結(jié)直腸癌患者病情評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)。3過表達(dá)miR-335-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與遷移,抑制miR-335-3p則相反。4 miR-335-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化。流式細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示:SW480和HT-29過表達(dá)miR-335-3p mimic后,G1/G0期細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組顯著減少(P0.05),S期細(xì)胞顯著增加(P0.05);抑制組則相反(P0.05);Western blot結(jié)果顯示CCND1、CDK2、CDK4、CDK6、pRb的表達(dá)水平在miR-335-3p過表達(dá)組明顯高于對(duì)照組,抑制組則相反,提示miR-335-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化。5 miR-335-3p抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示:過表達(dá)miR-335-3p可抑制結(jié)直腸癌SW480和HT-29細(xì)胞的凋亡,而抑制則相反(P0.05);Western blot結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào),提示miR-335-3p抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。6 APPL1是miR-335-3p的靶基因。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),證實(shí)APPL1是miR-335-3p的靶基因。7 APPL1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào),且APPL1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移(P0.05)。8 miR-335-3p靶向作用APPL1調(diào)控p-Akt信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與遷移。Westernblot檢測結(jié)果顯示:過表達(dá)miR-335-3p后,p-Akt的表達(dá)水平明顯上調(diào),p21、p27、Cleaved-casp9的表達(dá)水平明顯下調(diào);而過表達(dá)APPL1后,此作用減弱。提示miR-335-3p通過靶向作用APPL1調(diào)控p-Akt-p27/p21促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化、p-Akt-Casp9抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖;通過APPL1-p-Akt促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移。結(jié)論:本研究系統(tǒng)地探討了miR-335-3p及其靶基因APPL1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及作用;探討了miR-335-3p作為促癌因子通過APPL1-p-Akt信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與遷移的作用機(jī)制,為結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的研究及未來治療方向提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.34
【圖文】：

邐１逡逑＊＊：邋＾＜０．０１逡逑圖１－１．邋ｍｉＲ－３３５＿３ｐ在８６對(duì)結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平。Ｎｏｒｍａｌ：正常癌旁組織；Ｔｕｍｏｒ：逡逑結(jié)直腸癌腫瘤組織。逡逑Ｆｉｇｕｅ邋１－１．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－３３５￣３ｐ邋ｉｎ邋８６邋ｐａｉｒｓ邋ｏｆ邋ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ逡逑ｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｉｒ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｔｉｓｓｕｅｓ．逡逑Ｗ）邐Ｑ．逡逑ｐ邋＝邋１．２３４ｅ－０６邐Ｊ邐ＴＣＧＡ邋ｄａｔａｂａｓｅ逡逑Ｑ．逡逑ｘ邋１５－｜邐ａ邐１0－逡逑卜邋ｍｅｍ邋＾邋＾逡逑．．．．逡逑＾邐－邐２－逡逑？Ｃ邋０邐ｉ邐■邋■邐ｏ邐０邐ｉ邐ｉ逡逑Ｎｏｒｍａｌ邋（ｎ邋＝邋２邋Ｔｕｍｏｒ邋（ｎ邋＝邋４ｆ邐Ｎｏｒｍａｌ邋（ｎ邋＝邋２邋Ｔｕｍｏｒ邋（ｎ邋＝邋３逡逑圖１－２．邋ＴＣＧＡ結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)庫顯示ｍｉＲ－３３５的表達(dá)水平。逡逑Ｆｉｇｕｅ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－３３５邋ｉｎ邋ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｄａｔａｓｅｔ逡逑ｏｆ邋ＴＣＧＡ邋（ｎ＝４５７）．逡逑２邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ表達(dá)水平與患者相關(guān)臨床特征學(xué)的關(guān)系逡逑為了探討ｍｉＲ－３３５－３ｐ表達(dá)水平與患者臨床特征學(xué)的相關(guān)性，我們對(duì)８６對(duì)結(jié)逡逑直腸癌組織患者臨床資料進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Ｘ２檢驗(yàn)分析顯示：ｍｉＲ－３３５－３ｐ的逡逑表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（蘆０．邋００２）及ＡＪＣＣ分期（／Ｍ３．邋００３）密切相關(guān)（表１－１）

Ｎｏｒｍａｌ邋（ｎ邋＝邋２邋Ｔｕｍｏｒ邋（ｎ邋＝邋４ｆ邐Ｎｏｒｍａｌ邋（ｎ邋＝邋２邋Ｔｕｍｏｒ邋（ｎ邋＝邋３逡逑圖１－２．邋ＴＣＧＡ結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)庫顯示ｍｉＲ－３３５的表達(dá)水平。逡逑Ｆｉｇｕｅ邋１－２．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－３３５邋ｉｎ邋ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｄａｔａｓｅｔ逡逑ｏｆ邋ＴＣＧＡ邋（ｎ＝４５７）．逡逑２邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ表達(dá)水平與患者相關(guān)臨床特征學(xué)的關(guān)系逡逑為了探討ｍｉＲ－３３５－３ｐ表達(dá)水平與患者臨床特征學(xué)的相關(guān)性，我們對(duì)８６對(duì)結(jié)逡逑直腸癌組織患者臨床資料進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Ｘ２檢驗(yàn)分析顯示：ｍｉＲ－３３５－３ｐ的逡逑表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（蘆０．邋００２）及ＡＪＣＣ分期（／Ｍ３．邋００３）密切相關(guān)（表１－１），逡逑提示ｍｉＲ－３３５－３ｐ的表達(dá)上調(diào)可能與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)

Ｉ邐Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ逡逑＊＊：／＜０．０１逡逑圖２－４．邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ過表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２＿４．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｉｃａｃｙ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ邋ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ邋ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｖｉｒｕｓ邋ｗｅｒｅ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ｑ－ＰＣＲ．逡逑４邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響逡逑４．１邋ｍｉＲ－３３５－３ｐ促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外增殖逡逑利用邋ＣＣＫ８邋增殖實(shí)驗(yàn)檢測邋ＳＷ４８０－ｍｉＲ－３３５－３ｐ／ＳＷ４８０－ＮＣ，ＨＴ－２９－ｍｉＲ－３３５－３ｐ／逡逑ＨＴ－２９－ＮＣ細(xì)胞的體外增殖能力，結(jié)果顯示：ＳＷ４８０和ＨＴ－２９細(xì)胞ｍｉＲ－３３５－３ｐ過逡逑表達(dá)ｍｉｍｉｃｓ組的增殖速率均顯著高于對(duì)照（ＮＣ）組（圖２－５，表２－４、２－５，戶逡逑＜０．０５），其中ＳＷ４８０于第３天增殖差異最大（圖２－５，表２－４，邋／＜０．０１）；逡逑ｍｉＲ－３３５－３ｐ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ組的細(xì)胞增殖速率則均顯著低于對(duì)照（ＮＣ）組（圖２－５，逡逑表邋２－４、２—５，戶＜０．０５）。逡逑同時(shí)

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本文編號(hào)：2793060