【摘要】：組蛋白乙�；墙M蛋白翻譯后修飾的一種的重要方式,在調(diào)控真核生物的基因表達中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。組蛋白乙�；蓞⑴c多種細(xì)胞生物過程,因此,其異常調(diào)控與人類的多種疾病發(fā)生相關(guān)。這一修飾方式由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙酰轉(zhuǎn)移酶(HDACs)共同調(diào)節(jié)。MOF,也稱MYST1或KAT8,是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST家族(Moz-Ybf2/Sas3-Sas2-Tip60)的一員。MOF存在于兩種蛋白復(fù)合物(MSL和NSL)中發(fā)揮其生物學(xué)功能。這兩種復(fù)合物均可催化組蛋白H4第16位賴氨酸(H4K16)的乙�；�,而NSL復(fù)合物還可乙�；疕4K5和H4K8位點。MOF可調(diào)控多種細(xì)胞過程,在基因轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控、維持基因組穩(wěn)定性、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控及早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。MOF及其相關(guān)復(fù)合物活性異常可引起嚴(yán)重的細(xì)胞功能障礙,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞惡性增殖。研究證明,MOF及其作用底物H4K16的乙酰化水平缺失已成為人類腫瘤的一個普遍標(biāo)志。但也有研究發(fā)現(xiàn)MOF在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達,可見MOF在腫瘤發(fā)生中的調(diào)控作用是復(fù)雜多樣的,這提示我們MOF在不同腫瘤中的可能存在不同的調(diào)控靶點。MOF除了在腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用外,有研究報道MOF可調(diào)控T細(xì)胞的分化,T細(xì)胞特異性敲除MOF可導(dǎo)致小鼠免疫功能喪失,這表明MOF在調(diào)控T細(xì)胞功能中的重要性。另有研究報道在炎癥性腸病患者的結(jié)腸組織中H4K16的乙酰化水平存在異常,提示MOF可能在炎癥性疾病中同樣發(fā)揮重要作用。本研究分為兩個部分,第一部分初步探討了 MOF在實驗性結(jié)腸炎小鼠炎癥發(fā)生中的作用及可能的調(diào)控機制,第二部分研究了 MOF對乳腺癌中雌激素受體ERα表達的調(diào)控作用及機制,本研究的發(fā)現(xiàn)及得出的結(jié)論將豐富我們對MOF調(diào)控炎癥疾病及乳腺癌腫瘤作用機制的理解,并可能成為一個新的治療靶點。第一部分組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MOF在炎癥性腸病中的作用及調(diào)控機制研究目的:明確組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MOF在炎癥性結(jié)腸病中的作用,通過葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型研究了 MOF在小鼠實驗性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用,初步探討其可能的調(diào)控機制。研究方法:1.葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎發(fā)生過程中MOF的表達變化選擇6-8周齡雄性C57BL/6J野生型小鼠,收集飲用3.5%DSS誘導(dǎo)不同時間(第0、3、7天)結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織,提取RNA、蛋白和制備組織切片,分別利用RT-qPCR、Western blotting、組織免疫化學(xué)染色法,檢測MOF和H4K16ac在炎癥發(fā)生過程的表達情況。2.MOF基因缺失對DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展的影響通過Mofflox/flox和ER-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交獲得基因型為Mof flox/flox;-Cre+的小鼠,利用Cre/loxP重組酶系統(tǒng),腹腔注射他莫昔芬(TAM)誘導(dǎo)Cre重組酶表達而獲得Mof基因敲除小鼠(Mof-cKO)。選擇6-8周齡雄性的Mof fl/fl;ER-Cre-(對照)和Mof-cKO小鼠進行實驗,分別給予正常飲水和3.5%DSS溶液建立結(jié)腸炎模型。實驗過程中記錄小鼠體重變化、血便情況,結(jié)腸長度,對結(jié)腸組織切片進行HE染色并做組織病理學(xué)評分。3.MOF對Th17細(xì)胞相關(guān)基因表達的影響3.1 Western blotting檢測MOF對I117a蛋白表達的影響;3.2 RT-qPCR檢測MOF對Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達的影響,包括Thl7細(xì)胞分泌因子I117a和1122,轉(zhuǎn)錄因子RORyt、RORα和Sata3,分化調(diào)控因子TGF-β1 和 I1-6;3.3用MOF抗體進行ChIP-qPCR,檢測MOF在I117a和RORyt基因啟動子結(jié)合情況。4.RNA-seq分析敲低MOF對結(jié)腸組織基因表達譜的影響篩出炎癥相關(guān)的差異表達基因,分析其參與的信號通路。研究結(jié)果:1.RT-qPCR 和 Western blotting 結(jié)果說明,MOF 和 H4K16ac 在 DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎過程中表達上調(diào);2.IHC染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),在小鼠結(jié)腸炎發(fā)生過程中MOF主要分布在結(jié)腸組織黏膜層細(xì)胞中;3.Mof敲除后可改善小鼠的結(jié)腸炎癥狀,表現(xiàn)為體重下降程度減小,結(jié)腸縮短程度減小,HE染色結(jié)果組織病理學(xué)評分降低;4.Mof敲除可降低Th17細(xì)胞相關(guān)因子的表達,包括I117a、I122、RORyt、RORa、Sata3、TGF-β1 和 I1-6,Mof 可與 I117a 和 RORyt 啟動子區(qū)結(jié)合;5.RNA-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)655個差異表達基因,68個基因(10.4%)與炎癥反應(yīng)調(diào)控或免疫性疾病相關(guān),其中47個基因的表達是下調(diào)的。結(jié)論:1.MOF在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎反應(yīng)中表達逐漸升高,提示MOF參與DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎反應(yīng)。2.敲除MOF可改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的癥狀。3.敲除MOF可下調(diào)Th17細(xì)胞功能和分化關(guān)鍵因子的表達而減弱小鼠結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)。第二部分乳腺癌中組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MOF對雌激素受體ERα表達的調(diào)控作用研究目的:雌激素受體ERα激活異常是促進乳腺癌發(fā)生發(fā)展的危險因素,其表達缺失也是內(nèi)分泌治療耐藥和抵抗的重要原因,ERα蛋白再表達是恢復(fù)內(nèi)分泌治療敏感性的重要途徑。分析MOF和ERα在乳腺癌組織和細(xì)胞中的表達相關(guān)性,研究MOF對ERα蛋白表達的調(diào)控作用機制,為實現(xiàn)ERα蛋白再表達治療提供新的作用靶點。研究方法:1.乳腺癌組組織和細(xì)胞中MOF和ERα之間的表達相關(guān)性1.1利用谷歌生物公司的乳腺癌組織芯片,通過免疫組織化學(xué)法(IHC)分別檢測MOF和ERα在乳腺癌組織中表達情況,并分析兩種蛋白在乳腺癌組織中表達水平的相關(guān)性;1.2選擇ERα表達陽性的乳腺癌細(xì)胞系MCF7、T47D和ERα表達陰性的乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231 和 HCC1937,Western blotting 檢測 MOF 在 ERα 陽性和陰性乳腺癌細(xì)胞中的表達差異,在乳腺癌細(xì)胞系中確認(rèn)MOF和ERα的表達相關(guān)性;1.3在ERα陽性細(xì)胞系MCF7和T47D細(xì)胞中,通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染上調(diào)表達MOF 的 pcDNA3.0-Flag-HA-MOF(FH-MOF)及其空白載體(Vector)和敲低MOF 表達的 pGpu6-shMOF 及其對照 pGpu6-shControl,RT-qPCR、Western blotting檢測MOF表達變化對ERα表達的影響;1.4分別在無雌激素(E2)刺激和E2刺激的條件下,在MCF7細(xì)胞中過表達MOF,Western blotting檢測MOF對ERα蛋白的調(diào)控作用是否是E2依賴性的;1.5分別通過核質(zhì)分離實驗和細(xì)胞免疫熒光實驗,檢測MOF對E2刺激ERα蛋白細(xì)胞核定位改變的影響。2.MOF對ERα轉(zhuǎn)錄活性及介導(dǎo)的促乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響2.1對照MCF7細(xì)胞和MOF過表達MCF7細(xì)胞分別用E2 處理 0h、1h,3h和6h,RT-qPCR 檢測 MOF 對 E2 刺激 ERα 靶基因(TFF1,CCND1,GREB1)的激活表達影響;2.2用ERα抗體進行ChIP實驗,qPCR檢測MOF對ERα在靶基因啟動子結(jié)合能力的影響。2.3分別通過CCK8實驗和異種移植瘤實驗檢測MOF對E2促進MCF7細(xì)胞增和體內(nèi)成瘤能力的影響。3.MOF影響ERα蛋白水平的調(diào)控機制3.1在MCF7細(xì)胞,用MG132處理對照細(xì)胞和MOF過表達細(xì)胞,Western Blotting檢測MOF對ERα蛋白合成的影響;3.2在MCF7細(xì)胞,用CHX處理對照細(xì)胞和MOF過表達細(xì)胞,Western Blotting檢測MOF對ERα蛋白降解的影響;3.3在293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入6×His-ERα和FH-MOF質(zhì)粒,用CHX處理對照細(xì)胞和MOF過表達細(xì)胞,Western Blotting驗證MOF對ERα蛋白降解的影響;3.4用ERα抗體進行Co-IP實驗,Western Blotting檢測MOF對ERα蛋白泛素化水平的影響;4.MOF增加ERα蛋白泛素化水平的機制4.1通過對MOF過表達細(xì)胞RNA-sequencing結(jié)果分析和文獻查閱,并通過RT-qPCR和Western Blotting驗證,找到MOF影響其表達的E3連接酶Cul4a和Cul4b;4.2通過小干擾RNA siCul4a和siCul4b分別敲低Cul4a和Cul4b的表達,Western Blotting檢測對ERα蛋白表達的影響。4.3 Co-IP實驗驗證Cul4b與ERα蛋白的相互作用以及Cul4b對ERα蛋白泛素化水平的影響;4.4 Co-IP實驗驗證MOF對Cul4b與ERα蛋白之間相互作用的影響;4.5無E2刺激條件下,用Lys-Ac抗體進行Co-IP實驗,Western Blotting檢測MOF對HSP90和ERα乙酰化水平影響。4.6無E2刺激條件下,用ERα抗體進行Co-IP實驗,Western Blotting檢測MOF對HSP90和ERα相互作用的影響;5.MOF對ERα陰性乳腺癌細(xì)胞HCC1937細(xì)胞中ERα蛋白再表達的影響5.1 用 pGPU6-shMOF 質(zhì)粒敲低 HCC1937 細(xì)胞 MOF 表達,Western Blotting 檢測ERα蛋白表達情況;5.2用MOF小分子抑制劑MG149抑制HCC1937細(xì)胞中MOF酶活性,Western Blotting檢測ERα蛋白表達情況;5.3用MG149和他莫昔芬(TAM)共同處理HCC1937細(xì)胞,通過CCK8實驗檢測MOF對HCC1937細(xì)胞TAM抵抗作用的影響。研究結(jié)果:1.乳腺癌組織芯片IHC結(jié)果分析,MOF與ERα表達呈負(fù)相關(guān)性;2.在乳腺癌細(xì)胞系中分析MOF表達,結(jié)果表明MOF在ERα陽性細(xì)胞系中低表達,在ERα陽性細(xì)胞系中高表達;3.在MCF7和T47D細(xì)胞中,分別過表達和敲低MOF后ERα的mRNA水平無顯著變化,但過表達MOF可下調(diào)ERα蛋白水平,而敲低MOF可上調(diào)ERα蛋白水平;4.MG132處理MCF7細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MOF不影響ERα蛋白合成過程;5.CHX處理MCF7細(xì)胞,結(jié)果表明MOF可加速ERα蛋白的降解過程;6.在293T細(xì)胞中驗證,MOF可加速ERα蛋白的降解過程;7.Co-IP實驗檢測ERα蛋白泛素化水平變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MOF可增加ERα蛋白泛素化水平;8.MOF可上調(diào)Cu14a和Cu14b的表達,但干擾Cu14a表達后對ERα蛋白無明顯影響,而干擾Cu14b表達后可上調(diào)ERα蛋白表達,并恢復(fù)MOF對ERα蛋白的抑制作用;9.Co-IP實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cu14b和ERα可相互作用,干擾Cu14b表達后可減少ERα蛋白泛素化水平;10.過表達MOF可增強Cu14b和ERα的相互作用;11.無E2刺激條件下,過表達MOF可增加HSP90的乙�；�,并減弱HSP90和ERα相互作用;12.抑制MOF表達后可誘導(dǎo)HCC1937細(xì)胞中ERα蛋白再表達;13.MG149抑制HCC1937細(xì)胞中MOF酶活性后,ERα蛋白也可再表達;14.MG149和TAM共同處理HCC1937細(xì)胞后可恢復(fù)HCC1937細(xì)胞對TAM的敏感性。結(jié)論:1.在乳腺癌組織和細(xì)胞中MOF和ERα的蛋白表達水平呈負(fù)性相關(guān)關(guān)系。2.MOF抑制ERα蛋白表達及其介導(dǎo)的促乳腺癌細(xì)胞增殖能力。3.MOF通過泛素蛋白酶體途徑降低ERα蛋白穩(wěn)定性。4.MOF上調(diào)Cu14b的表達而增加ERα泛素化水平降低其蛋白穩(wěn)定性。5.無雌激素刺激時,MOF增加HSP90的乙�；绞蛊涫シ肿影閭H功能引起ERα的降解。6.抑制MOF酶活性可激活ERα陰性乳腺癌細(xì)胞中ERα蛋白表達,并提高對他莫西芬的敏感性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730.2
【圖文】：

方法檢測了小鼠結(jié)腸炎發(fā)生過程中ＭＯＦ及Ｈ４Ｋ１６ａｃ的表達情況。我們選擇給予逡逑３．５％邋ＤＳＳ自由飲水當(dāng)天為第０天，分別于第３天和第７天麻醉處死小鼠，取其逡逑遠(yuǎn)端結(jié)腸組織進行后續(xù)檢測。如圖１Ａ所示，１１１７ａ是己知的參與ＤＳＳ誘導(dǎo)結(jié)腸逡逑炎反應(yīng)的重要分子，ＲＴ－ｑＰＣＲ結(jié)果顯示１１１７ａ的ｍＲＮＡ水平于ＤＳＳ誘導(dǎo)第３天逡逑和第７天表達顯著升高，說明小鼠結(jié)腸組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。隨著ＤＳＳ誘導(dǎo)炎癥逡逑反應(yīng)加重，ＭＯＦ的ｍＲＮＡ表達水平于炎癥早期（第３天）開始顯著升高。與逡逑ｍＲＮＡ水平表達變化一致，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ結(jié)果顯示在ＤＳＳ誘導(dǎo)結(jié)腸炎發(fā)生過逡逑程中，ＭＯＦ的蛋白水平顯著升高（圖１Ｂ邋）。同時，Ｈ４Ｋ１６的乙�；剑ǎ龋矗耍保叮幔悖╁义媳憩F(xiàn)出與ＭＯＦ邋—致的變化（圖１Ｂ）。圖１Ｃ所示為圖１Ｂ中ＭＯＦ、Ｈ４Ｋ１６ａｃ和逡逑１１１７ａ的蛋白相對表達強度。我們還通過ＩＨＣ方法檢測了邋ＭＯＦ在小鼠結(jié)腸組織逡逑中的定位表達情況，發(fā)現(xiàn)在小鼠結(jié)腸炎發(fā)生過程中ＭＯＦ主要分布在結(jié)腸組織黏逡逑膜層細(xì)胞中（圖１Ｄ）。綜上所述，這些結(jié)果表明，ＭＯＦ參與ＤＳＳ誘導(dǎo)的結(jié)腸炎逡逑的炎癥反應(yīng)

注射ＴＡＭ，每只小鼠每天劑量為１００ｍｇ／ｋｇ，連續(xù)注射５天，４天后檢測小鼠結(jié)逡逑腸組織ＭＯＦ敲除效率。ＲＴ－ｑＰＣＲ結(jié)果顯示經(jīng)ＴＡＭ誘導(dǎo)后結(jié)腸組織中ＭＯＦ逡逑ｍＲＮＡ表達水平降低了約８０％（圖２Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測結(jié)果顯示ＭＯＦ蛋逡逑白水平也顯著降低（圖２Ｂ）。逡逑確認(rèn)ＭＯＦ敲除的效率后分別給予對照組小鼠和Ｍｏｆ－ｃＫＯ小鼠正常飲水和逡逑３．５％邋ＤＳＳ飲水處理，每天觀察記錄小鼠體重變化及血便情況，７天后麻醉處死逡逑各組實驗小鼠，取結(jié)腸組織檢測結(jié)腸炎各項指標(biāo)變化，包括體重下降程度、血便、逡逑結(jié)腸長度縮短和病理改變。如圖２Ｃ所示，正常飲水的對照組小鼠和Ｍｏｆ－ｃＫＯ小逡逑鼠體重之間沒有顯著差異，說明敲除ＭＯＦ表達后短期內(nèi)對小鼠體重沒有顯著影逡逑響。與對照組結(jié)腸炎小鼠相比，Ｍｏｆ－ｃＫＯ的結(jié)腸炎小鼠體重下降程度明顯減輕。逡逑Ｍｏｆ－ｃＫＯ結(jié)腸炎小鼠的血便量也顯著少于對照結(jié)腸炎小鼠。除此之外，正常飲水逡逑的對照組小鼠和Ｍｏｆ－ｃＫＯ小鼠的結(jié)腸長度沒有顯著差異，而Ｍｏｆ－ｃＫＯ結(jié)腸炎小逡逑鼠的結(jié)腸長度明顯長于對照結(jié)腸炎小鼠（圖２Ｄ、Ｅ）

與ＥＲ結(jié)合后，改變其構(gòu)象，與伴侶蛋白如熱休克蛋白ＨＳＰ９０分離，形成二聚體逡逑并與靶基因啟動子區(qū)的ＥＲＥ結(jié)合，再通過招募各種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（ＨＡＴ）等輔逡逑助激活因子促進基因轉(zhuǎn)錄活化（圖１）邋［＆９］。這一過程是經(jīng)典的雌激素信號通路。逡逑一些輔激活因子對ＥＲ功能是不可或缺的［１Ｑ，ｎ］。ＥＲ還可通過募集組蛋白脫乙酰逡逑酶（ＨＤＡＣ）結(jié)合來介導(dǎo)某些基因的抑制作用。上述過程為經(jīng)典的雌激素信號通路。逡逑ＥＲ已被證明通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用來調(diào)節(jié)基因的表達。因此，ＥＲ本逡逑身可作為輔助調(diào)控因子協(xié)助轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與ＤＮＡ序列的結(jié)合｜３］。ＥＲ通過逡逑非經(jīng)典基因組作用參與許多重要基因的調(diào)控，如ＣｙｃｌｉｎＤｌ、ＭＹＣ、ＢＣ１２和ＩＧＨＲ。逡逑ＥＲ的非經(jīng)典基因組作用不僅可能在乳腺癌細(xì)胞增殖和存活中發(fā)揮重要作用，也逡逑可能在內(nèi)分泌治療耐藥性的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。逡逑Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ逡逑Ｘ邋＾７ｌｆｌＥＧＲ，邋＼逡逑／邐Ｇｒｏｗｔｈ邐ＥＲＢＢ２邐＼逡逑ａ邋／邐ｆａｃｔｏｒｓ邐ａｎｄ邋ＩＧＦＲ邐邋＼邋ｃ逡逑／邐（Ｒａｓ）邋（ＰＩ３Ｋ）邐／邐＼逡逑Ｘ邋Ｉ邋ｉ邋ｄ邋Ｖ逡逑’邐？邋＠邐ｅ（ｆＥＬ翁逡逑＼邐？邋Ｗ邐４邐／逡逑＼邋、姞邐？邐？逡逑Ｃｙｔｏｐｌ＾ＪＵ邋一－邋＇邐ｔ逡逑０邐v|邋？邐？逡逑ＥＲＥ邐ＳＲＥ邐ＲＥ逡逑Ｖ邐ｍＲＮＡ邋Ｘ邐Ｊ逡逑、邐邐邋一＾ＡＡＡＡＡ邋＾’逡逑邐■逡逑ＭＹＣ，邋ｃｙｃｌｉｎ邋Ｄｌ，逡逑ｃｙｃｌｉｎ邋Ｅｌ邋ａｎｄ邋ｃｙｃｌｉｎ邋Ｅ２逡逑%煎義希牽潁錚鰨簦

本文編號：2792855