【摘要】：目的:肺癌包括非小細胞肺癌(Non small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌兩種,非小細胞肺癌約占肺癌總數(shù)的85%,主要包括肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)兩種病理類型,其中肺腺癌是目前最主要的病理類型。肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,根據(jù)2017年最新的腫瘤統(tǒng)計數(shù)據(jù),肺癌是發(fā)病率第二、死亡率最高的惡性腫瘤。盡管肺癌的診斷和治療有了快速進展,肺癌的預(yù)后仍很差,這是由于肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不完全清楚,因此對肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制的探索為提高其診斷和治療奠定了重要基礎(chǔ)。惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展是多基因綜合作用的結(jié)果,其中mRNA及其編碼的蛋白質(zhì)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有廣泛而重要的作用。近年來,非編碼RNA(non-conding RNA,ncRNA)得到廣泛關(guān)注。非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA,人類基因組有超過90%的基因轉(zhuǎn)錄為RNA但并未編碼為蛋白質(zhì)。非編碼RNA可分為管家非編碼RNA和調(diào)節(jié)非編碼RNA,其中調(diào)節(jié)非編碼RNA中的微小RNA(miRNA)可參與基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié),miRNA可以通過抑制腫瘤相關(guān)基因,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤中也發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用,其吸附miRNA,通過miRNA影響其下游靶基因是lncRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的機制之一。環(huán)狀RNA(Circular RNAs,circRNAs)是最近新發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA,以共價結(jié)合的閉合環(huán)狀形式存在。環(huán)狀RNA具有表達豐度高、穩(wěn)定存在,在人和鼠中具有保守性,具有細胞和組織特異性表達等特征。隨著技術(shù)發(fā)展,發(fā)現(xiàn)某些環(huán)狀RNA在腫瘤中存在差異表達,進一步研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,此外環(huán)狀RNA對腫瘤的診斷和預(yù)后也有重要價值。環(huán)狀RNA可以吸附miRNA從而解除miRNA對下游靶基因的抑制作用,捕獲RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein,RBP),并可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。其中環(huán)狀RNA作為miRNA海綿從而調(diào)節(jié)靶基因表達是迄今為止我們知道環(huán)狀RNA的最重要作用機制。肺癌中環(huán)狀RNA的研究尚處于起始階段,研究報道了少數(shù)環(huán)狀RNA參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。cir-ITCH在肺癌組織中表達水平較低,發(fā)揮抑癌作用;此外,環(huán)狀RNA hsa_circ_0014130、hsa_circ_0000064、hsa_circ_0007385、hsa_circ_0013958在肺癌中作為癌基因,促進肺癌發(fā)生發(fā)展。最近的研究表明circPUM1在卵巢癌中表達上調(diào),并且能夠促進卵巢癌的發(fā)生發(fā)展,因此我們提出假設(shè)circPUM1在肺癌特別是肺腺癌發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮作用。因此,本研究旨在探索circPUM1在肺腺癌組織及細胞系中的表達水平及其對肺腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響,并研究circPUM1影響肺腺癌細胞生物學(xué)行為可能的分子機制。研究方法:1.組織標本及RNA提取選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科住院的肺腺癌患者,所有患者均經(jīng)至少兩名病理學(xué)家確認為肺腺癌。收取其癌組織和癌旁組織,于-80℃冰箱保存。加入1ml trizol試劑,按照操作說明提取RNA,檢測260和280nm處吸光度值得到RNA的濃度和純度。利用pomega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。本研究經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準。2.qPCR檢測組織標本及細胞系環(huán)狀RNA表達水平Takara實時定量試劑盒檢測肺腺癌患者癌組織和癌旁組織中環(huán)狀RNA circPUM1的表達水平,按照操作說明在Roche lightcycler 480實時定量PCR儀上進行,每次反應(yīng)均包含陽性及陰性質(zhì)控。采用18s作為內(nèi)參進行標準化,2~(-ΔΔCT)方法計算相對表達量。所用的前向引物為:5'-AGTGTACTGGGAGGAGG-3',反向引物為:5'-ATAAGTCCGTGCGTCC-3'。人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1975、SPC-A1以及人正常肺上皮細胞16HBE細胞接種于6孔板,待次日長滿后加入1 ml trizol試劑將細胞裂解,按照操作說明提取RNA。Takara實時定量試劑盒檢測幾種細胞系中環(huán)狀RNA circPUM1的表達水平。3.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、H1975、SPC-A1以及人正常肺上皮細胞16HBE均購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。其中A549細胞用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液,H1975、SPC-A1細胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,而16HBE細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。所有細胞均在37℃、5%CO_2、濕度飽和的孵箱中進行培養(yǎng),每2-3天更換培養(yǎng)液。環(huán)狀circPUM1過表達及sh質(zhì)粒分別由吉賽公司和漢恒生物科技有限公司構(gòu)建。選取circPUM1高表達的細胞系轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒降低其表達水平,選擇低表達的細胞系轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒升高其表達水平。采用lipofactomine 3000進行轉(zhuǎn)染實驗,之后加入嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的細胞。4.MTT細胞活性測定將3×10~3個轉(zhuǎn)染過表達或shRNA質(zhì)粒的細胞接種到96孔板中,每次設(shè)置對照孔及空白孔。分別在0h、24h、48h、72h,將20μl MTT溶液加到鋪好細胞的96孔板中,孵育1-4小時后,加入二甲基亞砜(DMSO)酶標儀讀取490nm的吸光度值。5.EdU檢測DNA合成能力細胞接種于24孔板,第二天以10μM的EdU標記6-8h,孵育之后用4%多聚甲醛固定細胞,用Alexa Fluor 488標記EdU,并且用Hoechst 33342染細胞核,PBS洗兩次,熒光顯微鏡下拍照。Image J軟件分析EdU陽性細胞的百分比。6.細胞凋亡檢測收集細胞后,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗兩次,按操作說明,每管加入5μl Annexin V-APC和5μl 7-AAD混勻,室溫避光15分鐘后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。7.細胞劃痕實驗細胞接種于6孔板中,培養(yǎng)到細胞匯合度80%左右時,用200ul槍尖劃痕,細胞用PBS洗兩次并在無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。分別在0、24、48小時時在顯微鏡下觀察劃痕并拍照。用Image J軟件測量劃痕區(qū)域,劃痕愈合率=(原劃痕面積-不同時間點劃痕面積)/原劃痕面積*100%。8.Transwell細胞侵襲實驗明膠基質(zhì)包被的transwell細胞培養(yǎng)小室用來進行侵襲實驗。5×10~4個A549細胞或SPC-A1細胞重懸于200ul無血清培養(yǎng)液中,平鋪于transwell小室的上層,底層含有600ul完全培養(yǎng)液作為趨化劑。37℃孵育48小時后,用棉簽去除小室上層的細胞,侵襲到上層小室底部的細胞用甲醛固定,結(jié)晶紫染色并用顯微鏡拍照。9.熒光素酶報告基因?qū)嶒?93T細胞接種于96孔板中,并轉(zhuǎn)染野生型或突變型熒光素酶質(zhì)粒(漢恒)及相應(yīng)的miRNA。孵育48h后雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測firefly和renilla熒光素酶活性。相對熒光信號以firefly熒光素酶活性/renilla熒光素酶活性表示。10.裸鼠體內(nèi)成瘤實驗4周大的免疫缺陷BALB/c裸鼠購自北京維通利華公司,在中國醫(yī)科大學(xué)動物部飼養(yǎng)。轉(zhuǎn)染sh-circPUM1和sh-NC質(zhì)粒的A549細胞收獲、清洗并重懸于PBS中,1×10~7細胞(0.1 ml)接種到裸鼠皮下。每3天監(jiān)測腫瘤大小,并按照如下公式計算腫瘤體積:腫瘤體積(mm~3)=長×寬~2/2,40天后將老鼠處死。11.Western blot檢測蛋白質(zhì)水平總蛋白收獲并用RIPA裂解液(包含蛋白酶抑制劑)裂解。蛋白裂解物經(jīng)10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。3%BSA室溫封閉膜兩個小時,之后加入一抗,4℃過夜孵育。二抗室溫孵育2小時后,用凝膠圖像分析儀采集圖像并分析。12.統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量數(shù)據(jù)兩組均值比較采用t檢驗,計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。p≤0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果:1.肺腺癌患者癌組織及肺腺癌細胞系中circPUM1表達增高qPCR檢測肺腺癌患者癌組織和癌旁組織標本circPUM1表達水平,結(jié)果顯示癌組織中circPUM1水平顯著高于癌旁組織(p0.05),且與腫瘤TNM分期相關(guān),TNM分期越高表達水平越高。此外,三種肺腺癌細胞系及人正常肺上皮細胞16HBE中檢測circPUM1表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌細胞中circPUM1表達水平高于人肺正常上皮細胞。其中A549細胞表達水平較高,因此選擇A549細胞轉(zhuǎn)染sh-circPUM1質(zhì)粒進行circPUM1敲減;SPC-A1細胞表達水平較低,選擇對其進行circPUM1過表達。2.circPUM1影響肺腺癌細胞增殖首先進行MTT實驗評估circPUM1對細胞增殖的影響,A549細胞進行circPUM1敲減后,OD490吸光度值降低(p0.05)提示其細胞增殖能力顯著降低;而SPC-A1細胞過表達circPUM1后,OD490吸光度值升高(p0.05)細胞增殖能力明顯增強。此外,我們還進行了EdU細胞增殖實驗評估circPUM1敲除或過表達對DNA復(fù)制水平的影響。結(jié)果顯示A549細胞進行circPUM1敲減后,EdU陽性細胞的百分比顯著降低(p0.05),而SPC-A1細胞過表達circPUM1后,EdU陽性細胞的百分比增高(p0.05)。3.circPUM1影響肺腺癌細胞凋亡A549細胞轉(zhuǎn)染sh-circPUM1質(zhì)粒后,細胞凋亡水平均較對照組顯著增加(p0.05);而SPC-A1細胞轉(zhuǎn)染circPUM1質(zhì)粒后,細胞凋亡水平顯著降低(p0.05)。4.circPUM1影響肺腺癌細胞遷移和侵襲能力劃痕實驗中A549細胞轉(zhuǎn)染sh-circPUM1質(zhì)粒后,48h劃痕愈合百分比較對照組顯著降低(p0.05);Transwell結(jié)果顯示A549細胞敲減circPUM1后,侵襲到下室的細胞數(shù)較對照組顯著減少(p0.05)。而SPC-A1細胞過表達circPUM1后,得到完全相反的結(jié)果。5.circPUM1敲減抑制裸鼠體內(nèi)成瘤裸鼠移植瘤模型體內(nèi)驗證circPUM1在肺腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。裸鼠被隨機分為兩組,分別皮下接種轉(zhuǎn)染sh-circPUM1和sh-NC的A549細胞。與對照組比較,sh-circPUM1組裸鼠的腫瘤生長速度明顯較慢,相同的觀察時間內(nèi)腫瘤體積較小(p0.05)。6.circPUM1與miRNA相互作用Circular RNA Interactome網(wǎng)站預(yù)測circPUM1存在miR-326互補序列,提示兩者可能存在相互作用。熒光素酶雙報告基因?qū)嶒烇@示miR-326能顯著降低野生型circPUM1熒光素酶質(zhì)粒的相對熒光活性(p0.05),而對突變型circPUM1熒光素酶質(zhì)粒的相對熒光活性無顯著影響。結(jié)果提示circPUM1可作為miR-326海綿吸附miR-326。7.miR-326下游靶蛋白檢測Western blot結(jié)果顯示,與對照組比較,circPUM1過表達顯著上調(diào)cyclin D1(CCND1)和Bcl-2的蛋白表達水平;相反,circPUM1敲減后CCND1和Bcl-2的表達水平降低。結(jié)論:1.環(huán)狀RNA circPUM1在肺腺癌患者癌組織中表達水平較癌旁組織高,且與腫瘤TNM分期相關(guān)。2.體外功能試驗顯示:環(huán)狀RNA circPUM1能夠促進肺腺癌細胞增殖、抑制其凋亡,并能夠促進其侵襲和遷移能力。3.體內(nèi)敲減circPUM1表達能夠顯著抑制裸鼠體內(nèi)成瘤。4.環(huán)狀RNA circPUM1通過吸附miR-326,進而調(diào)節(jié)其下游蛋白Cyclin D1、Bcl-2表達,從而影響肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展。5.研究揭示了circPUM1在肺癌中的分子調(diào)節(jié)作用,circPUM1調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的闡明能夠加速對肺癌發(fā)生發(fā)展的研究。此外,circPUM1-miR-326軸可能作為肺腺癌及其它相關(guān)疾病的潛在治療靶點,改善其臨床干預(yù)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2;R730.43
【圖文】：

采用 SPSS 20.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)和標準差表示，t 檢驗比較數(shù)據(jù)間是否有差異。統(tǒng)計概率采用雙側(cè)檢驗，以 α≤0.05 為顯著性水準。3 結(jié)果3.1 環(huán)狀 RNAcircPUM1 鑒定及其在肺腺癌細胞系中表達水平應(yīng)用 circPUM1 引物擴增環(huán)狀 RNA 后，接口處序列進行測序，測序結(jié)果顯示 circPUM1 符合在 circBase 中編號為 hsa_circ_0000043 的環(huán)狀 RNA。三種肺腺癌細胞系及人肺正常上皮細胞 16HBE 中檢測 circPUM1 表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌細胞中 circPUM1 表達水平高于人肺正常上皮細胞。其中 A549 細胞表達水平較高，SPC-A1 細胞表達水平較低，因此后續(xù)功能實驗選擇 A549 細胞進行circPUM1 敲減，選擇 SPC-A1 細胞進行 circPUM1 過表達。

1.2 肺腺癌細胞系及人肺正常上皮細胞中 circPUM1 表達對象基本情況共納入 70 例肺腺癌患者，其臨床特征構(gòu)成：男性 29 例（（58.6%）；60 歲以上（含 60 歲）44 例（62.9%），60 歲以TNM 分期Ⅰ期 22 例（31.4%），Ⅱ期 21 例（30.0%），Ⅲ-Ⅳ

圖 1.3 肺腺癌患者癌組織及癌旁組織 circPUM1 表達cPUM1 表達水平與臨床病理特征相關(guān)性分析們進一步分析了 circPUM1 表達水平與臨床病理因素的相關(guān)性，結(jié)1 表達水平與 TNM 分期相關(guān)，分期越高表達水平越高（p<0.05UM1 表達水平與年齡、性別等因素相關(guān)。

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2 陳建波,羅一魯,郭中敏,陳系古;單純皰疹病毒胸苷激酶基因在肺腺癌細胞的表達[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2002年11期

3 崔虎山,李星云,李成福,韓京軍,池永涌;三磷酸腺苷氯化鎂對肺腺癌細胞的抗癌作用[J];延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報;2002年03期

4 閆承慧,吳焱,金焰,傅松濱;不同轉(zhuǎn)移能力的肺腺癌細胞系金屬蛋白酶活性分析[J];遺傳;2000年04期

5 賈心善,戴小淳,張立紅,裴惠敏,赫明昌;肺腺癌細胞系的免疫細胞化學(xué)研究——肺癌腫瘤標記研究之Ⅲ[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1986年Z1期

6 ;氣管、肺[J];中國癌癥防治雜志;1988年02期

7 劉雪立;曹銀生;李國謙;;肺腺癌胸膜廣泛轉(zhuǎn)移并神經(jīng)肌肉綜合征一例報告[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1988年03期

8 季晨陽,張義R

本文編號：2792102