【摘要】：研究背景和目的:去整合素金屬蛋白酶12(ADisintegrin And Metalloproteinase 12,ADAM12)是去整合素蛋白酶家族的一員。它主要有兩個(gè)亞型,一個(gè)是跨膜的L型ADAM12L,另外一個(gè)是分泌的S型ADAM12S。它們主要由前肽結(jié)構(gòu)域、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素結(jié)構(gòu)域、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域以及上皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。但它們的C端彼此不同,ADAM12S在其C端具有額外的34個(gè)氨基酸,取代ADAM12L中的205個(gè)氨基酸的跨膜和胞質(zhì)尾區(qū)。末端結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致它們有不同的細(xì)胞定位和生物學(xué)功能。近年研究報(bào)道,ADAM12在多種癌癥中高表達(dá),如小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌以及腦癌。也報(bào)道了在乳腺癌和前列腺癌病人的尿液中ADAM12的表達(dá)量與其病情息息相關(guān)。它能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移,因而逐漸成為臨床診斷的生物標(biāo)志物。ADAM12作為一種金屬蛋白酶,現(xiàn)有研究主要集中在尋找它的水解底物,探討如何通過其酶的活性影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是還沒有系統(tǒng)的研究它在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)是如何被調(diào)控。我們前期已經(jīng)通過質(zhì)譜高通量方法篩選找到了 ADAM12L的相互作用蛋白,并且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)ADAM12L的上游調(diào)控蛋白Myoferlin能夠影響ADAM12L的酶活性。然而,對(duì)于ADAM12S的相互作用蛋白以及它們之間是否存在某種調(diào)控關(guān)系并影響其功能等問題還沒有闡明。本論文主要通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定ADAM12S的相互作用蛋白,并探索它們之間的調(diào)控關(guān)系及對(duì)ADAM12S功能的影響。研究方法:我們通過在HeLa細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)ADAM12S-FLAG,收集細(xì)胞提蛋白后進(jìn)行FLAG M2親和樹脂免疫純化,并將純化下來的樣品進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證蛋白純化。通過對(duì)純化的樣品進(jìn)行銀染,發(fā)現(xiàn)差異條帶后,將膠上的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的條帶分別等分,膠內(nèi)酶解蛋白成多肽后,通過LC-MS/MS進(jìn)行分析。將得到的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer以及MaxQuant進(jìn)行定量分析處理,獲得可能與ADAM12S相互作用的蛋白。對(duì)這些蛋白的功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析,找到可能影響ADAM12S功能的蛋白,進(jìn)而通過生物化學(xué)方法驗(yàn)證它們之間的相互作用,探究它們的相互調(diào)控關(guān)系以及對(duì)ADAM12S功能的影響。研究結(jié)果:我們通過兩次蛋白質(zhì)組學(xué)生物學(xué)重復(fù)和兩種定量分析方法鑒定到了16個(gè)與ADAM12S特異性相互作用的蛋白,其中只有一個(gè)蛋白與ADAM12L和ADAM12S共同作用。一方面,我們通過生物化學(xué)方法驗(yàn)證了 GRP94、P4HB、PDIA6、Vimentin、CANX等蛋白與ADAM12的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)GRP94、PDIA6和P4HB均特異性地與ADAM12S相互作用,Vimentin特異性地與ADAM12L相互作用,CANX與ADAM12的兩個(gè)亞型都有相互作用,這些實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜結(jié)果一致。在與ADAM12S相互作用的蛋白中,我們發(fā)現(xiàn)了很多參與蛋白質(zhì)折疊、促進(jìn)蛋白分泌的分子伴侶,而且這些蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。另一方面,我們通過分子對(duì)接計(jì)算機(jī)模擬分析了 GRP94與ADAM12的相互作用,結(jié)果顯示與ADAM12L相比,ADAM12S與GRP94結(jié)合更緊密。通過反拉實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)一步確證了它們之間的相互作用。在過表達(dá)GRP94的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)了 GRP94可以上調(diào)ADAM12S,而敲低GRP94后,細(xì)胞內(nèi)的ADAM12S表達(dá)量降低,分泌到培養(yǎng)基內(nèi)的ADAM12S成熟體也明顯降低。雖然ADAM12S與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶P4HB和PDIA6均有相互作用,但是P4HB并不影響ADAM12S的蛋白水平,而PDIA6能夠上調(diào)ADAM12S的表達(dá)。我們進(jìn)一步通過劃痕實(shí)驗(yàn)證明了 ADAM12S促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移。研究結(jié)論:通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了 ADAM12S特異性相互作用蛋白,并且通過生物化學(xué)方法證實(shí)它們之間的作用,發(fā)現(xiàn)GRP94可以通過增加ADAM12S的表達(dá)并促進(jìn)其分泌。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族的PDIA6和P4HB都能和ADAM12S相互作用,但是只有PDIA6能夠影響其蛋白水平。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：2789069