【摘要】：研究目的:通過研究自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)與化療藥物順鉑(cisplatin,DDP)聯(lián)合應(yīng)用對口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡情況的影響,結(jié)合ABT-263抑制Bcl-2前后口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62與抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)變化,以期初步探討CAL-27細(xì)胞生物學(xué)行為及自噬與凋亡的可能關(guān)聯(lián)。采用免疫組織化學(xué)方法研究53例口腔鱗狀細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1的表達(dá),分析自噬在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征間的關(guān)系,旨在為口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新的方向。研究方法:1.應(yīng)用CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度、不同時間下,3-MA、DDP作用于口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27后細(xì)胞生長情況,篩選實(shí)驗(yàn)所需3-MA藥物濃度,計(jì)算DDP半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC_(50))作為實(shí)驗(yàn)濃度,檢測空白對照組、3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組作用細(xì)胞24 h后細(xì)胞抑制率;2.應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測空白對照組、3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組作用細(xì)胞24 h后遷移侵襲細(xì)胞數(shù)及其遷移侵襲指數(shù);3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測空白對照組、3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組作用細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡情況;4.Western blotting法檢測應(yīng)用3-MA、ABT-263前后細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1、P62的表達(dá)情況;5.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測53例口腔鱗狀細(xì)胞癌石蠟標(biāo)本中LC3、Beclin1的表達(dá)情況。研究結(jié)果:1.CCK-8檢測結(jié)果示:3-MA、DDP分別單純作用于CAL-27細(xì)胞24 h、48 h及72 h后,細(xì)胞生長受到抑制,抑制率隨時間延長及藥物濃度的增加而增加,即具有時間及藥物濃度依賴性�？瞻讓φ战M與3-MA組細(xì)胞活力無明顯差別,DDP組及3-MA+DDP組細(xì)胞生長受到抑制,且3-MA+DDP組(OD值=0.445±0.029)細(xì)胞增殖活力明顯小于DDP組(OD值=0.657±0.038,P=0.000);2.采取Transwell遷移實(shí)驗(yàn)比較空白對照組、3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組小室下表面遷移細(xì)胞數(shù):藥物作用24 h后,與空白對照組(127.25±4.03個)相比,3-MA組(119.75±5.12個)的遷移細(xì)胞數(shù)無明顯減少,DDP組(77.5±6.19個)、3-MA+DDP組(51.75±7.68個)遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少,且3-MA+DDP組遷移細(xì)胞數(shù)較DDP組更少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對照組相比,3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組的遷移指數(shù)分別為94.11%、60.90%、40.67%;采取Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)比較四組穿透Matrigel后小室下表面細(xì)胞數(shù):藥物作用24 h后,與空白對照組(183.25±4.11個)比,3-MA組(178.25±2.22個)的小室下表面細(xì)胞數(shù)無明顯減少,DDP組(84.25±6.40個)、3-MA+DDP組(51.50±4.20個)小室下表面細(xì)胞數(shù)顯著減少,且3-MA+DDP組小室下表面細(xì)胞數(shù)較DDP組更少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與空白對照組相比,3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組的侵襲指數(shù)分別為97.27%、45.98%、28.10%;3.流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測四組細(xì)胞的凋亡情況:空白對照組及3-MA組細(xì)胞無明顯凋亡,DDP組較空白對照組、3-MA組細(xì)胞凋亡率明顯增加(凋亡率為31.1%),3-MA+DDP聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率較DDP組顯著增加,可達(dá)57.6%;4.Western blotting法檢測結(jié)果示:空白對照組自噬相關(guān)蛋白處于基礎(chǔ)水平,應(yīng)用3-MA抑制劑后,自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)下降。應(yīng)用Bcl-2抑制劑ABT-263后,P62表達(dá)無明顯變化,Beclin1表達(dá)降低;5.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:LC3、Beclin1主要表達(dá)于細(xì)胞漿,LC3在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率(73.58%)顯著高于癌旁組織中的表達(dá)(7.14%,P0.05);Beclin1在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率(43.40%)顯著高于癌旁組織中的表達(dá)(7.14%,P0.05)。分析顯示:LC3、Beclin1的表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史均無明顯相關(guān)性(P(29)0.05);與口腔鱗狀細(xì)胞癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P0.05),腫瘤分化程度越低,LC3、Beclin1的陽性表達(dá)率越低。相比未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中,LC3、Beclin1的陽性表達(dá)率降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。研究結(jié)論:1.DDP可誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬;3-MA可抑制細(xì)胞自噬水平,這種抑制具有時間、藥物濃度依賴性;2.單純應(yīng)用實(shí)驗(yàn)所選3-MA作用細(xì)胞24 h對細(xì)胞增殖無明顯抑制作用。3-MA聯(lián)合DDP作用細(xì)胞24 h可降低DDP的IC_(50)值,即3-MA可增強(qiáng)CAL-27細(xì)胞對DDP的敏感性,但仍需動物模型實(shí)驗(yàn)及臨床相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步研究;3.LC3、Beclin1蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),且表達(dá)水平與患者的腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);4.Beclin1自噬信號通路與Bcl-2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān),可作為研究治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的新方向。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.8
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、 3-甲基腺嘌呤抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌自噬對其增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響（2）將 Matrigel 膠與無血清 DMEM 培養(yǎng)基按 1∶5 稀釋，取 45 μl 均勻鋪到Transwell 上室內(nèi),將小室放入 24 孔板中，37 ℃恒溫孵育 4 h 待其凝固成膠狀；（3）余步驟同 1.1.4.9。1.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)OD值及細(xì)胞數(shù)以 x±s 表示，采用多個獨(dú)立樣本的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以 P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.2 結(jié)果1.2.1 口腔鱗狀細(xì)胞癌 CAL-27 細(xì)胞培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞大小均勻，結(jié)構(gòu)清晰，連接緊密，細(xì)胞漿豐富，形態(tài)呈鋪路石狀，具有上皮樣細(xì)胞的特征。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、 3-甲基腺嘌呤抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌自噬對其增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響（2）將 Matrigel 膠與無血清 DMEM 培養(yǎng)基按 1∶5 稀釋，取 45 μl 均勻鋪到Transwell 上室內(nèi),將小室放入 24 孔板中，37 ℃恒溫孵育 4 h 待其凝固成膠狀；（3）余步驟同 1.1.4.9。1.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)OD值及細(xì)胞數(shù)以 x±s 表示，采用多個獨(dú)立樣本的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以 P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.2 結(jié)果1.2.1 口腔鱗狀細(xì)胞癌 CAL-27 細(xì)胞培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞大小均勻，結(jié)構(gòu)清晰，連接緊密，細(xì)胞漿豐富，形態(tài)呈鋪路石狀，具有上皮樣細(xì)胞的特征。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、 3-甲基腺嘌呤抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌自噬對其增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響（2）將 Matrigel 膠與無血清 DMEM 培養(yǎng)基按 1∶5 稀釋，取 45 μl 均勻鋪到Transwell 上室內(nèi),將小室放入 24 孔板中，37 ℃恒溫孵育 4 h 待其凝固成膠狀；（3）余步驟同 1.1.4.9。1.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)OD值及細(xì)胞數(shù)以 x±s 表示，采用多個獨(dú)立樣本的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以 P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.2 結(jié)果1.2.1 口腔鱗狀細(xì)胞癌 CAL-27 細(xì)胞培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞大小均勻，結(jié)構(gòu)清晰，連接緊密，細(xì)胞漿豐富，形態(tài)呈鋪路石狀，具有上皮樣細(xì)胞的特征。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 鄭天亮;何占鋒;趙松;;3-甲基腺嘌呤聯(lián)合化療對食管癌原位移植瘤治療作用及機(jī)制[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2017年12期

2 王智明;張雨霏;葉明;楊東升;馬穎;周卓;ZHANG Li-ping;LIU Wei-xian;;自噬相關(guān)基因Bcelin-1與凋亡相關(guān)基因Bcl-2在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與意義[J];臨床軍醫(yī)雜志;2015年07期

3 全海英;周麗佳;李昂迪;張澤兵;;氯喹增強(qiáng)口腔癌CAL-27細(xì)胞對順鉑化療敏感性的觀察[J];上海口腔醫(yī)學(xué);2015年01期

本文編號：2783997