發(fā)布時間：2020-08-07 12:29

【摘要】：研究目的:通過研究自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)與化療藥物順鉑(cisplatin,DDP)聯(lián)合應(yīng)用對口腔鱗狀細胞癌CAL-27細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡情況的影響,結(jié)合ABT-263抑制Bcl-2前后口腔鱗狀細胞癌CAL-27細胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、P62與抗凋亡蛋白Bcl-2的表達變化,以期初步探討CAL-27細胞生物學(xué)行為及自噬與凋亡的可能關(guān)聯(lián)。采用免疫組織化學(xué)方法研究53例口腔鱗狀細胞癌石蠟標(biāo)本中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1的表達,分析自噬在口腔鱗狀細胞癌中的表達情況及其與臨床病理特征間的關(guān)系,旨在為口腔鱗狀細胞癌的治療提供新的方向。研究方法:1.應(yīng)用CCK-8增殖實驗檢測不同濃度、不同時間下,3-MA、DDP作用于口腔鱗狀細胞癌CAL-27后細胞生長情況,篩選實驗所需3-MA藥物濃度,計算DDP半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC_(50))作為實驗濃度,檢測空白對照組、3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組作用細胞24 h后細胞抑制率;2.應(yīng)用Transwell實驗分別檢測空白對照組、3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組作用細胞24 h后遷移侵襲細胞數(shù)及其遷移侵襲指數(shù);3.應(yīng)用流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測空白對照組、3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組作用細胞24 h后細胞凋亡情況;4.Western blotting法檢測應(yīng)用3-MA、ABT-263前后細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1、P62的表達情況;5.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測53例口腔鱗狀細胞癌石蠟標(biāo)本中LC3、Beclin1的表達情況。研究結(jié)果:1.CCK-8檢測結(jié)果示:3-MA、DDP分別單純作用于CAL-27細胞24 h、48 h及72 h后,細胞生長受到抑制,抑制率隨時間延長及藥物濃度的增加而增加,即具有時間及藥物濃度依賴性。空白對照組與3-MA組細胞活力無明顯差別,DDP組及3-MA+DDP組細胞生長受到抑制,且3-MA+DDP組(OD值=0.445±0.029)細胞增殖活力明顯小于DDP組(OD值=0.657±0.038,P=0.000);2.采取Transwell遷移實驗比較空白對照組、3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組小室下表面遷移細胞數(shù):藥物作用24 h后,與空白對照組(127.25±4.03個)相比,3-MA組(119.75±5.12個)的遷移細胞數(shù)無明顯減少,DDP組(77.5±6.19個)、3-MA+DDP組(51.75±7.68個)遷移細胞數(shù)顯著減少,且3-MA+DDP組遷移細胞數(shù)較DDP組更少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與空白對照組相比,3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組的遷移指數(shù)分別為94.11%、60.90%、40.67%;采取Transwell侵襲實驗比較四組穿透Matrigel后小室下表面細胞數(shù):藥物作用24 h后,與空白對照組(183.25±4.11個)比,3-MA組(178.25±2.22個)的小室下表面細胞數(shù)無明顯減少,DDP組(84.25±6.40個)、3-MA+DDP組(51.50±4.20個)小室下表面細胞數(shù)顯著減少,且3-MA+DDP組小室下表面細胞數(shù)較DDP組更少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與空白對照組相比,3-MA組、DDP組、3-MA+DDP組的侵襲指數(shù)分別為97.27%、45.98%、28.10%;3.流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測四組細胞的凋亡情況:空白對照組及3-MA組細胞無明顯凋亡,DDP組較空白對照組、3-MA組細胞凋亡率明顯增加(凋亡率為31.1%),3-MA+DDP聯(lián)合用藥組細胞凋亡率較DDP組顯著增加,可達57.6%;4.Western blotting法檢測結(jié)果示:空白對照組自噬相關(guān)蛋白處于基礎(chǔ)水平,應(yīng)用3-MA抑制劑后,自噬相關(guān)蛋白LC3表達下降。應(yīng)用Bcl-2抑制劑ABT-263后,P62表達無明顯變化,Beclin1表達降低;5.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:LC3、Beclin1主要表達于細胞漿,LC3在口腔鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率(73.58%)顯著高于癌旁組織中的表達(7.14%,P0.05);Beclin1在口腔鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率(43.40%)顯著高于癌旁組織中的表達(7.14%,P0.05)。分析顯示:LC3、Beclin1的表達與口腔鱗狀細胞癌患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史均無明顯相關(guān)性(P(29)0.05);與口腔鱗狀細胞癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P0.05),腫瘤分化程度越低,LC3、Beclin1的陽性表達率越低。相比未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中,LC3、Beclin1的陽性表達率降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。研究結(jié)論:1.DDP可誘導(dǎo)口腔鱗狀細胞癌CAL-27細胞發(fā)生保護性自噬;3-MA可抑制細胞自噬水平,這種抑制具有時間、藥物濃度依賴性;2.單純應(yīng)用實驗所選3-MA作用細胞24 h對細胞增殖無明顯抑制作用。3-MA聯(lián)合DDP作用細胞24 h可降低DDP的IC_(50)值,即3-MA可增強CAL-27細胞對DDP的敏感性,但仍需動物模型實驗及臨床相關(guān)試驗進一步研究;3.LC3、Beclin1蛋白在口腔鱗狀細胞癌中高表達,且表達水平與患者的腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);4.Beclin1自噬信號通路與Bcl-2介導(dǎo)的細胞凋亡相關(guān),可作為研究治療口腔鱗狀細胞癌的新方向。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.8
【圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、 3-甲基腺嘌呤抑制口腔鱗狀細胞癌自噬對其增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響（2）將 Matrigel 膠與無血清 DMEM 培養(yǎng)基按 1∶5 稀釋，取 45 μl 均勻鋪到Transwell 上室內(nèi),將小室放入 24 孔板中，37 ℃恒溫孵育 4 h 待其凝固成膠狀；（3）余步驟同 1.1.4.9。1.1.5 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS Statistics 17.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組數(shù)據(jù)OD值及細胞數(shù)以 x±s 表示，采用多個獨立樣本的方差分析進行統(tǒng)計，以 P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。1.2 結(jié)果1.2.1 口腔鱗狀細胞癌 CAL-27 細胞培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察，細胞大小均勻，結(jié)構(gòu)清晰，連接緊密，細胞漿豐富，形態(tài)呈鋪路石狀，具有上皮樣細胞的特征。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、 3-甲基腺嘌呤抑制口腔鱗狀細胞癌自噬對其增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響（2）將 Matrigel 膠與無血清 DMEM 培養(yǎng)基按 1∶5 稀釋，取 45 μl 均勻鋪到Transwell 上室內(nèi),將小室放入 24 孔板中，37 ℃恒溫孵育 4 h 待其凝固成膠狀；（3）余步驟同 1.1.4.9。1.1.5 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS Statistics 17.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組數(shù)據(jù)OD值及細胞數(shù)以 x±s 表示，采用多個獨立樣本的方差分析進行統(tǒng)計，以 P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。1.2 結(jié)果1.2.1 口腔鱗狀細胞癌 CAL-27 細胞培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察，細胞大小均勻，結(jié)構(gòu)清晰，連接緊密，細胞漿豐富，形態(tài)呈鋪路石狀，具有上皮樣細胞的特征。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、 3-甲基腺嘌呤抑制口腔鱗狀細胞癌自噬對其增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響（2）將 Matrigel 膠與無血清 DMEM 培養(yǎng)基按 1∶5 稀釋，取 45 μl 均勻鋪到Transwell 上室內(nèi),將小室放入 24 孔板中，37 ℃恒溫孵育 4 h 待其凝固成膠狀；（3）余步驟同 1.1.4.9。1.1.5 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS Statistics 17.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組數(shù)據(jù)OD值及細胞數(shù)以 x±s 表示，采用多個獨立樣本的方差分析進行統(tǒng)計，以 P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。1.2 結(jié)果1.2.1 口腔鱗狀細胞癌 CAL-27 細胞培養(yǎng)倒置相差顯微鏡下觀察，細胞大小均勻，結(jié)構(gòu)清晰，連接緊密，細胞漿豐富，形態(tài)呈鋪路石狀，具有上皮樣細胞的特征。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 鄭天亮;何占鋒;趙松;;3-甲基腺嘌呤聯(lián)合化療對食管癌原位移植瘤治療作用及機制[J];中華實驗外科雜志;2017年12期

2 王智明;張雨霏;葉明;楊東升;馬穎;周卓;ZHANG Li-ping;LIU Wei-xian;;自噬相關(guān)基因Bcelin-1與凋亡相關(guān)基因Bcl-2在舌鱗狀細胞癌中的表達與意義[J];臨床軍醫(yī)雜志;2015年07期

3 全海英;周麗佳;李昂迪;張澤兵;;氯喹增強口腔癌CAL-27細胞對順鉑化療敏感性的觀察[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2015年01期

本文編號：2783997