【摘要】：肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的肝臟腫瘤,也是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和致死率在世界范圍內(nèi)分別位于第六位和第三位。越來越多的研究證實,非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是肝癌的獨立危險因素,NAFLD甚至可以直接致癌而不經(jīng)過肝硬化。NAFLD發(fā)病率在西方國家大約是20～30%,而在亞洲大約為5-18%,并且呈逐年上升趨勢。鑒于NAFLD的高發(fā)病率及其與HCC發(fā)生的密切相關性,揭示NAFLD發(fā)生機制及其向HCC轉變的可能機制,對于NAFLD及HCC的預防及治療均具有重要意義。NAFLD發(fā)病機制復雜,其促癌機制尚不清楚。脂代謝異常介導的游離脂肪酸增多及肝細胞脂質(zhì)沉積是NAFLD形成和發(fā)展的先決條件。脂代謝異常不僅誘發(fā)NAFLD,而且也是多種實體瘤的重要表型。除了對葡萄糖的利用加快之外,肝癌等多種腫瘤脂質(zhì)代謝旺盛,表現(xiàn)出“生脂”表型或脂質(zhì)水解增多、脂肪酸攝取活躍。隨著腫瘤發(fā)病機制研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)許多癌基因和抑癌基因參與代謝信號通路的調(diào)控。因此,癌基因、抑癌基因介導的代謝異�？赡苁荖AFLD發(fā)生及進展為HCC的重要機制。ZHX2 (zinc fingers and homobox 2)屬于ZHX家族。該家族包括三個具有高度同源性的成員ZHX1、ZHX2和ZHX3。ZHX2蛋白能通過其HD1結構域自身聚合形成同源二聚體,也可以與其同家族成員ZHX1或ZHX3以及轉錄因子NF-YA形成異源二聚體,發(fā)揮抑制轉錄的功能。文獻及我們的前期研究顯示,ZHX2調(diào)控甲胎蛋白(a fetal protein, AFP)、Glypican-3 (GPC3)等重要HCC標志物及細胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin E表達,在肝癌中發(fā)揮抑癌基因作用。家族型高脂血癥及動脈粥樣硬化個體的遺傳分析發(fā)現(xiàn),ZHX2基因為高脂血癥易感基因,且ZHX2轉基因動物血脂水平顯著升高,提示ZHX2與脂質(zhì)代謝異常相關。然而,ZHX2如何調(diào)控脂代謝,其機制如何?ZHX2調(diào)控脂代謝是否參與NAFLD,進而通過調(diào)控脂代謝影響HCC發(fā)生,迄今尚未見報道。本課題擬深入研究ZHX2在非酒精性脂肪肝和肝細胞肝癌發(fā)生中的作用及其分子機制,并對其在改善腫瘤化療耐藥性中的作用進行探討。第一部分ZHX2調(diào)控脂蛋白脂酶參與脂肪肝及肝細胞肝癌的作用及機制機體脂質(zhì)代謝復雜,涉及脂肪酸攝取、脂蛋白水解轉運、脂質(zhì)合成、脂質(zhì)氧化及再利用等多個過程。相關研究提示ZHX2與血漿脂質(zhì)代謝異常相關。本實驗室前期芯片結果顯示ZHX2表達與一系列脂質(zhì)代謝相關基因表達有相關性,脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase, LPL)就是其中之一。LPL是機體水解脂蛋白的關鍵酶,其生物學功能分為兩部分：一部分為甘油三酯的水解酶作用,可將血液中的乳糜微粒和極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,VLDL)所攜帶的甘油三酯水解,釋放的游離脂肪酸(Free fatty acid, FFA)可被細胞直接攝取；另一部分則是受體介導的脂蛋白內(nèi)吞作用的橋梁,可與脂蛋白殘粒附著、結合,介導細胞對脂蛋白殘粒的攝取。越來越多的研究顯示,LPL在乳腺癌、脂肪肉瘤等多種實體瘤中高表達,并與這些腫瘤的預后差相關,提示LPL參與腫瘤發(fā)生。然而,LPL是否參與ZHX2介導的脂代謝調(diào)控及ZHX2介導的腫瘤抑制作用,迄今尚不清楚。本課題擬從ZHX2對LPL的調(diào)控作用,探討ZHX2調(diào)控脂代謝及其在NAFLD和HCC中的作用及機制。一、ZHX2在多種肝癌細胞系中顯著抑制LPL表達為明確ZHX2對LPL表達的調(diào)控作用,分別進行ZHX2過表達及siRNA干擾實驗。利用脂質(zhì)體在ZHX2本底表達低的細胞系HepG2、BEL7402、HEK293中轉染ZHX2過表達質(zhì)粒pcDNA3.0-ZHX2-HA, pcDNA3.0空載體為對照；在ZHX2本底表達高的細胞系SMMC7721、QSG7701細胞系中轉染ZHX2siRNA, negtive control為對照。Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)和Western Blot (WB)檢測結果顯示,ZHX2過表達能夠明顯抑制不同細胞內(nèi)LPL的表達,而干擾ZHX2, LPL表達顯著上調(diào)。以上結果說明ZHX2抑制LPL的表達。二、ZHX2通過Octamer位點負性調(diào)控LPL啟動-子活性1.ZHX2顯著抑制LPL啟動子活性首先構建LPL全長啟動子報告質(zhì)粒pGL3-LPLp (-1678～+67),分別與ZHX2過表達載體共轉染HepG2細胞和CHO細胞,與ZHX2 siRNA共轉染SMMC7721、QSG7701細胞。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,ZHX2過表達能明顯抑制LPL啟動子活性,而干擾ZHX2表達,LPL啟動子活性顯著升高。將不同劑量的ZHX2表達質(zhì)粒與相同劑量的LPL啟動子報告質(zhì)粒共轉染HepG2細胞,雙熒光素酶報告檢測結果顯示,ZHX2對LPL啟動子活性的抑制作用呈劑量依賴性。2.轉錄起始點上游-96～-38nt是ZHX2抑制LPL啟動子的關鍵片段為尋找ZHX2調(diào)控LPL啟動子活性的關鍵位點,利用轉錄因子預測軟件TFSEARCH分析LPL啟動子中的轉錄因子位點,據(jù)此構建LPL系列截短啟動子報告質(zhì)粒(上游分別為-981、-816、-666、-430、-196、-96、-38,下游均為+67)。將這些報告質(zhì)粒與ZHX2過表達載體共轉染SMMC7721細胞系,檢測啟動子活性。結果顯示,直到截短至-96-+67片段,ZHX2對其活性仍有很好的抑制作用,而只有啟動子片段-38-+67不受ZHX2的影響。說明ZHX2在LPL啟動子上的作用位點位于-96--38之間。3.ZHX2通過Octamer抑制LPL啟動子活性根據(jù)轉錄因子結合位點的分布,重新構建截短啟動子-52～+67,共轉染實驗顯示ZHX2仍舊對其活性有很好的抑制作用。TFSEARCH軟件分析顯示,LPL啟動子-52～-38之間的重要的轉錄因子結合位點只有一個,即Octamer。為驗證其作用,設計突變引物,利用突變試劑盒將該區(qū)域的Octamer位點進行突變,并構建報告質(zhì)粒pGL3-LPLp-96-Octamer-mutant。共轉染及雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,突變LPL啟動子-52--38間的Octamer位點,ZHX2對LPL啟動子活性的抑制作用消失,提示該區(qū)域Octamer位點是ZHX2調(diào)控LPL啟動子活性的關鍵位點。為了進一步證實以上結果,將含有野生型及突變的Octamer片段的LPL啟動子區(qū)-46～-39片段克隆至pGL3-promoter載體。共轉染及雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示ZHX2能夠抑制含有野生型Octamer片段的啟動子活性,而不能抑制Octamer位點突變的啟動子活性。轉錄因子軟件TFSEARCH預測顯示與Octamer位點相鄰的-70～-65區(qū)域存在NF-YA的結合位點CCAAT。NF-YA是重要的LPL轉錄調(diào)控因子,且ZHX2能夠與NF-Y A結合發(fā)揮轉錄抑制作用。為研究NF-YA在ZHX2介導的LPL轉錄調(diào)控中的作用,將NF-YA siRNA與pcDNA3.0-ZHX2-HA及LPL啟動子報告質(zhì)粒共轉染HepG2田胞。結果顯示,干擾NF-YA表達不影響ZHX2對LPL啟動子的抑制作用,提示NF-YA不參與ZHX2介導的LPL啟動子活性調(diào)控。4. EMSA及ChIP實驗顯示ZHX2能與LPL啟動子Octamer位點結合為研究ZHX2與LPL啟動子能否結合,將pcDNA3.0-ZHX2-HA轉染HepG2細胞,提取核蛋白,進行染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)。對 HA抗體免疫沉淀后的DNA進行PCR擴增,結果顯示,ZHX2能夠與含有 Octamer的LPL啟動子-96～+67片段結合,但不能與不含有Octamer的-177--67片段結合。為進一步研究ZHX2與Octamer的結合,分別用pcDNA3.0 及 pcDNA3.0-ZHX2-HA轉染HEK293細胞,提取胞核蛋白。根據(jù)LPL啟動子序列設計合成Octamer探針,凝膠阻滯實驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)結果顯示,含ZHX2的核蛋白能與標記探針很好的結合,該結合能被未標記探針競爭性抑制,加入HA抗體的super shift實驗進一步驗證了ZHX2蛋白能與Octamer序列的特異性結合。5. Co-IP實驗顯示ZHX2可以與轉錄因子Oct-1結合ZHX2含有與蛋白相互作用的HD1功能域。為研究ZHX2能否跟與Octamer結合的轉錄因子Oct-1結合,用pcDNA3.0-ZHX2-HA轉染HepG2細胞后,提取細胞總蛋白,進行免疫共沉淀(Immunoprecipitation, IP)實驗。結果顯示,IP抗體ZHX2雜交的蛋白能夠與Oct-1結合,說明ZHX2能夠與轉錄因子Oct-1相互結合。三、ZHX2通過抑制LPL減輕肝癌細胞系及小鼠肝臟的脂肪變LPL是機體水解脂蛋白的限速酶,并介導肝細胞攝取脂蛋白,在多種脂代謝相關疾病中發(fā)揮重要作用。ZHX2對LPL的調(diào)控作用提示ZHX2參與脂代謝相關疾病,為驗證該假說,進行如下實驗：1.ZHX2通過抑制LPL,減輕脂肪乳誘導的HepG2細胞脂肪變(1)脂肪乳誘導HepG2細胞脂肪變模型中ZHX2與LPL表達負相關首先檢測不同濃度脂肪乳對細胞活力的影響,用不含游離脂肪酸的但含不同濃度(0.2%、0.4%、0.8%、1%、2%)脂肪乳的1%BSA培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HepG2細胞,用CCK-8法檢測細胞活力。結果發(fā)現(xiàn)72h內(nèi),0.4%及更小濃度的脂肪乳不會影響HepG2細胞活力。用不同濃度的脂肪乳(0.2%、0.4%、1%)誘導HepG2細胞脂肪變,檢測細胞中ZHX2和LPL的表達變化與脂肪變程度的關系。結果發(fā)現(xiàn),隨著脂肪乳濃度的升高,細胞脂肪變程度增強,細胞內(nèi)ZHX2表達降低而LPL的表達升高。(2)ZHX2抑制脂肪乳誘導的HepG2細胞脂肪沉積,LPL過表達逆轉上述過程將pEGFP-N1-ZHX2轉染HepG2細胞,24h后加入0.4%脂肪乳。24h后,油紅O染色顯示脂質(zhì)沉積,DAPI染核。鏡下觀察,結果顯示,EGFP-ZHX2陽性細胞脂質(zhì)沉積明顯少于周圍細胞。提示,ZHX2抑制肝細胞脂肪沉積。為研究LPL在ZHX2抑制肝細胞脂肪變中的作用,構建LPL過表達載體 pcDNA3.0-LPL-HA。將不同劑量的LPL過表達載體與ZHX2過表達載體共轉染HepG2細胞,然后用0.4%脂肪乳誘導脂肪變。48h后,超聲裂解細胞,化學發(fā)光法檢測細胞裂解液中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量。結果發(fā)現(xiàn)LPL能夠明顯促進細胞的脂質(zhì)沉積,且共表達LPL和ZHX2的細胞,脂肪變的程度明顯比ZHX2單獨轉染組細胞脂質(zhì)沉積多。說明LPL參與ZHX2抑制HepG2細胞脂肪變過程。2.ZHX2通過負調(diào)控LPL表達抑制小鼠肝臟脂肪變(1)脂肪肝小鼠模型肝組織中ZHX2表達顯著降低為進一步研究ZHX2及LPL在脂肪肝中的可能作用,分別利用膽堿-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline-Deficient,MCD)飲食及高脂飲食(High-fat diet,HFD)誘導小鼠脂肪肝模型。抽提肝組織RNA,RT-PCR檢測Afrl(小鼠ZHX2)及LPL的表達。結果顯示,不論是哪種方式誘導的小鼠肝臟脂肪變,其肝內(nèi)Afrl的表達均明顯低于正常飲食組,相應的LPL的表達均高于正常飲食組。提示,ZHX2調(diào)控LPL參與肝臟脂肪變。(2)干擾ZHX2促進小鼠肝臟脂肪變?yōu)轵炞CZHX2在體內(nèi)參與肝臟脂肪變的作用,構建針對Afrl的小干擾慢病毒Lenti-Virus-Afrl-shRNA,以每只小鼠3x10^7 TU慢病毒,10%體重(m1)的量,尾靜脈高壓注射C57BL/6小鼠,一周后MCD飼喂。每周稱體重,兩周后處死小鼠,稱肝重,肝臟大體拍照,肝勻漿液測TG。肝冰凍切片油紅O檢測脂質(zhì)沉積,并用IPP6.0分析脂質(zhì)沉積面積。肝石蠟切片做HE染色,觀察肝損傷。結果顯示,MCD成功誘導肝臟脂肪變,且干擾Afr1表達顯著加重MCD誘導的肝臟脂肪變。(3)過表達LPL逆轉ZHX2對MCD誘導小鼠脂肪肝的抑制作用為進一步體內(nèi)驗證LPL在ZHX2抑制肝脂肪變中的作用,尾靜脈高壓注射法分別將ZHX2過表達質(zhì)粒、LPL過表達質(zhì)粒單獨或聯(lián)合注入小鼠體內(nèi),每只小鼠60μg質(zhì)粒,注射體積同上。注射后2天進行MCD飲食。每隔5天補注射一次質(zhì)粒。2周后處死小鼠,處理同上。結果顯示ZHX2過表達組脂肪變程度最輕,LPL過表達組最重,ZHX2與LPL聯(lián)合組介于兩者之間,即過表達LPL能顯著逆轉ZHX2對肝脂肪變的保護作用。說明LPL參與ZHX2抑制小鼠脂肪肝發(fā)生。四、ZHX2通過下調(diào)LPL表達抑制肝癌細胞體內(nèi)外生長文獻報道乳腺癌、脂肪肉瘤組織中LPL表達顯著增加,并促進乳腺癌細胞生長。為研究LPL在ZHX2抑制HCC生長中的作用,進行如下實驗：1.肝癌患者癌組織LPL表達明顯高于癌旁組織,且ZHX2與LPL表達顯著負相關收集22例肝細胞肝癌及其對應的癌旁組織標本,提取RNA并逆轉錄。實時熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR, Q-PCR)檢測LPL表達量。結果顯示HCC組織的LPL表達量明顯高于癌旁(p0.05)為了進一步證實上述結果,購買HCC組織芯片(含有75例患者癌和癌旁組織切片)。免疫組化結果顯示,癌組織LPL染色明顯強于癌旁組織。對染色結果進行評分,統(tǒng)計學分析顯示,LPL在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(p0.05)。為了驗證HCC標本中ZHX2對LPL表達的調(diào)控作用,選取肝癌臨床標本及組織芯片標本連續(xù)切片共97例,分別進行ZHX2和LPL免疫組化染色。結果顯示：ZHX2表達與LPL表達存在明顯的負相關關系(p0.05),即LPL在高表達ZHX2的HCC中的表達顯著低于低表達ZHX2的HCC。2.LPL以脂質(zhì)依賴性方式顯著促進HepG2肝癌細胞系的生長免疫組織化學染色結果顯示HCC組織中LPL異常高表達,并與抑癌基因ZHX2顯著負相關,提示LPL參與HCC發(fā)生發(fā)展。為研究LPL對HCC生長的作用,用LPL過表達載體分別轉染HepG2、SMMC7721、QSG7701細胞后,CCK-8法檢測細胞生長。結果發(fā)現(xiàn),在含10%FCS的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)情況下,LPL明顯促進HCC細胞生長。醫(yī)用注射用脂肪乳類似于乳糜微粒,是醫(yī)院病房常備藥。此前,本課題用較高濃度(0.4%)脂肪乳誘導HepG2脂肪變。本實驗設濃度梯度(0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、1%、2%)脂肪乳,培養(yǎng)72h。細胞活性檢測發(fā)現(xiàn),0.1%脂肪乳不僅不對肝細胞造成損傷,反而能夠補足1%BSA因為脂蛋白缺乏造成的細胞生長減緩。為驗證脂蛋白對LPL促細胞生長作用的影響,分別在含10%小牛血清(Fetal calf serum, FCS)完全培養(yǎng)基、含1%BSA的培養(yǎng)基、及含1%BSA和0.1%脂肪乳的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),CCK-8檢測細胞活力。結果顯示,完全培養(yǎng)基中LPL能夠明顯促進細胞生長。當使用含1%BSA的培養(yǎng)基代替含10%FCS的正常培養(yǎng)基后,因為脂蛋白和游離脂肪酸的缺乏,細胞生長明顯減慢,且LPL的促生長作用消失。3.LPL明顯改善ZHX2對肝癌細胞的生長抑制作用,該作用依賴于脂質(zhì)的存在為研究LPL在ZHX2抑制肝癌細胞生長中的作用,將LPL過表達質(zhì)粒與ZHX2過表達質(zhì)粒共轉染HepG2細胞后,分別在含1 0%FCS完全培養(yǎng)基、僅含1%BSA的培養(yǎng)基、及含1%BSA和0.1%脂肪乳的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),CCK-8檢測細胞活力。結果顯示,完全培養(yǎng)基中LPL過表達顯著破壞ZHX2對HepG2細胞生長的抑制作用,而撤除脂質(zhì)(1%BSA培養(yǎng)基),該作用消失,添加0.1%脂肪乳后LPL對ZHX2抑癌作用的逆轉作用恢復。4.LPL能夠逆轉ZHX2對荷瘤小鼠體內(nèi)H22肝癌細胞生長的抑制作用為驗證LPL體內(nèi)逆轉ZHX2抑制肝癌細胞生長的作用,取腹腔活化的腹水瘤H22細胞2x10∧7/ml,按照100ul/只小鼠,皮下注射建立荷瘤小鼠。3天后,瘤徑約3-5mm時,按照20μg/100μl量,瘤內(nèi)注射質(zhì)粒：pcDNA3.0, pcDNA3.0-ZHX2-HA, pcDNA3.0-LPL-HA, pcZHX2+pcLPL。每隔兩天測瘤徑及瘤內(nèi)注射質(zhì)粒。15天后,殺鼠取瘤,稱瘤重,拍照。結果顯示,LPL過表達顯著促進荷瘤鼠體內(nèi)肝癌細胞生長,且LPL過表達有效逆轉ZHX2對荷瘤鼠體內(nèi)HCC的抑制作用。綜上,本研究通過一系列體內(nèi)外實驗及臨床標本檢測,首次闡明ZHX2對LPL轉錄負調(diào)控的分子機制并首次報道LPL在HCC癌組織的異常高表達及其促HCC生長作用。研究表明ZHX2作為一種轉錄抑制因子,除了已知的對癌基因和周期蛋白的抑制之外,還可通過對脂代謝重要酶LPL的轉錄抑制,從而抑制肝細胞脂肪沉積,延緩脂肪肝的發(fā)生,并通過抑制LPL介導的脂肪攝取及累積抑制HCC生長。第二部分ZHX2通過下調(diào)MDR1增強腫瘤細胞的化療敏感性腫瘤細胞內(nèi)脂代謝異�；钴S,大量合成或攝取的脂肪酸一方面為腫瘤細胞生長供能,一方面形成腫瘤細胞中富含飽和脂肪酸的生物膜系統(tǒng),使腫瘤細胞更能耐受射線損傷及藥物的毒性作用,成為腫瘤耐藥的機制之一。臨床研究發(fā)現(xiàn),骨髓瘤患者ZHX2表達與患者的藥物耐受性顯著相關,提示ZHX2在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用。P蛋白(又稱為腫瘤多藥耐藥蛋白1, Multidrug resistance 1, MDR1)不僅能夠將化療藥物泵出細胞外,導致多種腫瘤耐藥,還能將飲食來源的膽固醇泵入胞內(nèi)。其啟動子區(qū)存在NF-Y結合位點,并且NF-YA能夠正調(diào)控MDR1啟動子活性。本課題設計實驗研究ZHX2能否通過對MDR1的調(diào)控達到改善HCC及肺癌細胞化療敏感性的效果。一、ZHX2顯著增強不同腫瘤細胞的化療敏感性1.ZHX2表達水平與腫瘤細胞化療敏感性相關本實驗首先用肝癌細胞系和肺癌細胞系同時驗證化療藥物順鉑(CDDP)對細胞的毒性。結果顯示,ZHX2內(nèi)源性表達高的細胞系(SMMC7721, A549), CDDP對細胞的抑制率高,提示ZHX2可能會影響腫瘤細胞的化療敏感性。2.ZHX2增強肝癌及肺癌細胞系對順鉑及阿霉素的敏感性將不同的細胞系分別轉染ZHX2的過表達質(zhì)粒和siR,NA后,加入不同濃度的CDDP和阿霉素(ADM),24h后,CCK-8檢測細胞存活率,并計算半數(shù)抑制濃度IC50值。結果顯示：ZHX2過表達組IC50值顯著低于pcDNA3.0對照組；而相對陰性對照(Negative control,NC)組,ZHX2 siRNA組(ZHX2-1674,ZHX2-2360)IC50值均明顯升高。上述結果顯示,ZHX2可以改善腫瘤細胞對CDDP.ADM的耐藥性。3.ZHX2促進CDDP介導的腫瘤細胞凋亡為了進一步驗證上述結果,選取耐藥性較高的細胞系HepG2,過表達ZHX2后,用CDDP(20ug/ml,24h)誘導細胞凋亡。用AnnexinV-PI標記凋亡細胞,流式檢測各組細胞凋亡情況。結果顯示,ZHX2聯(lián)合CDDP組細胞早期凋亡最多,說明ZHX2能夠增強化療藥物CDDP對HepG2細胞的損傷。二、ZHX2負向調(diào)控不同腫瘤細胞系中MDRl表達MDR1是與腫瘤多藥耐藥性密切相關的基因,且其啟動子區(qū)NF-Y結合位點的存在提示我們此基因極有可能也被ZHX2所調(diào)控。為了驗證ZHX2對MDR1表達的抑制作用,分別將ZHX2過表達載體和ZHX2 siRNAs轉染入不同細胞系。RT-PCR及WB結果顯示,ZHX2過表達明顯抑制肝癌及肺癌細胞系中MDR1表達；而用ZHX2 siRNAs干擾ZHX2,不同腫瘤細胞中MDR1的表達均明顯上調(diào)。三、ZHX2顯著抑制不同腫瘤細胞中的MDR1藥物泵功能MDRl又被稱為P蛋白,可以以ATP依賴性方式將包括化療藥物在內(nèi)的多種物質(zhì)選擇性泵出細胞外。為驗證ZHX2對MDR1藥物泵的抑制作用,分別將pEGFP-N1-ZHX2轉染HepG2和SPC-A-1細胞,24h后,加入40μg/ml ADM.作用4h后,DAPI染核。鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)ZHX2陽性細胞內(nèi)ADM含量明顯高于周圍其他細胞。將pEGFP-N1-ZHX2轉染HepG2,24h后,加入40μg/ml ADM。一組細胞繼續(xù)培養(yǎng)2h,待檢測藥物富集；另一組細胞換成不含ADM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)2h,待檢測藥物潴留,最后計算藥物釋放指數(shù)。流式結果顯示,EGFP陽性細胞群ADM富集多,潴留多,釋放少。上述實驗結果顯示,ZHX2可以顯著抑制藥物外流從而增加細胞內(nèi)藥物濃度。四、ZHX2通過影響NF-YA與MDR1啟動子相應元件結合抑制MDR1轉錄1.ZHX2劑量依賴性抑制MDR1啟動子活性ZHX2具有轉錄抑制活性。為研究ZHX2對MDR1啟動子活性的抑制作用,分別將ZHX2過表達載體或ZHX2 siRNAs與MDR1啟動子報告基因質(zhì)粒共轉染不同的腫瘤細胞系。雙熒光素酶報告基因檢測顯示,增強ZHX2表達能顯著抑制MDR1啟動子活性,而干擾ZHX2能顯著增強MDR1啟動子活性,且均呈劑量依賴性。2.ZHX2以NF-YA依賴性方式抑制MDR1轉錄活性在MDR1野生型啟動子報告質(zhì)粒pGL3-Mp的基礎上,構建ATTGG元件突變的MDR1啟動子載體pGL3-mMp,并將這兩種載體分別與ZHX2過表達載體或pcDNA3.0共轉染HepG2細胞,檢測ZHX2對啟動子活性的影響。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,NF-YA結合位點突變后,ZHX2對啟動子活性的抑制作用消失。與此相一致,將NF-YA siRNA、ZHX2過表達質(zhì)粒及MDR1啟動子報告質(zhì)粒共轉染HepG2細胞,發(fā)現(xiàn)干擾NF-YA表達后ZHX2對MDR1啟動子的抑制作用消失。3.免疫共沉淀實驗證實,腫瘤細胞中ZHX2能與NF-YA結合為了確認ZHX2與NF-YA的相互作用,將ZHX2過表達載體轉染HepG2細胞。48小時后裂解細胞,用NF-YA抗體及同型對照IgG作為IP抗體。免疫沉淀后的蛋白,用ZHX2抗體和NF-YA抗體進行WB。結果顯示與NF-YA抗體結合的蛋白也能與ZHX2抗體結合,即ZHX2與NF-YA結合。4.ZHX2干擾NF-YA與MDR1啟動子的結合為進一步研究ZHX2對MDR1的轉錄調(diào)控機制,分別在HepG2細胞和SPC-A-1細胞中過表達ZHX2,將ZHX2過表達蛋白分別與NF-YA 、 HA抗體孵育,按照前面的方法進行ChIP實驗。結果證實ZHX2及NF-YA均能與MDR1啟動子區(qū)相結合,且ZHX2過表達明顯減弱NF-YA與MDR1啟動子區(qū)的結合。EMSA實驗進一步證實,含CCAAT原件的探針能夠與過表達ZHX2的HepG2細胞核蛋白結合。上述結果提示,ZHX2通過與NF-YA相互競爭CCAAT位點而抑制MDR1啟動子活性。五、腫瘤組織標本檢測顯示耐藥基因MDRl與ZHX2表達存在負相關關系為在臨床標本中驗證ZHX2對MDR1的調(diào)控作用,收集30例HCC臨床標本和54例肺癌(其中肺鱗癌33例,肺腺癌21例)臨床標本,免疫組化檢測ZHX2和MDR1表達,評分后統(tǒng)計學分析其相關性。結果顯示,無論是肝癌組織還是肺癌組織,ZHX2表達均與MDR1表達顯著負相關(肝癌,p0.05；肺癌,p0.001),即MDR1低表達腫瘤組織中ZHX2表達量明顯高于MDR1高表達組(肝癌,p0.05；肺癌,p0.01)。綜上所述,ZHX2可通過轉錄負調(diào)控MDR1,降低肝癌及肺癌的多藥耐藥性。ZHX2調(diào)控MDR1可能的分子機制是通過與NF-YA相互競爭CCAAT位點而導致MDR1啟動子活性的降低。本研究提示ZHX2可增強腫瘤的化療敏感性,為腫瘤的基因治療又添有力證據(jù)。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5;R735.7

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 David Yiu-Kuen But;Ching-Lung Lai;Man-Fung Yuen;;Natural history of hepatitis-related hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2008年11期

本文編號：2778338