發(fā)布時(shí)間：2020-08-02 09:27

【摘要】：肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的肝臟腫瘤,也是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和致死率在世界范圍內(nèi)分別位于第六位和第三位。越來越多的研究證實(shí),非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,NAFLD甚至可以直接致癌而不經(jīng)過肝硬化。NAFLD發(fā)病率在西方國家大約是20～30%,而在亞洲大約為5-18%,并且呈逐年上升趨勢。鑒于NAFLD的高發(fā)病率及其與HCC發(fā)生的密切相關(guān)性,揭示NAFLD發(fā)生機(jī)制及其向HCC轉(zhuǎn)變的可能機(jī)制,對于NAFLD及HCC的預(yù)防及治療均具有重要意義。NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其促癌機(jī)制尚不清楚。脂代謝異常介導(dǎo)的游離脂肪酸增多及肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積是NAFLD形成和發(fā)展的先決條件。脂代謝異常不僅誘發(fā)NAFLD,而且也是多種實(shí)體瘤的重要表型。除了對葡萄糖的利用加快之外,肝癌等多種腫瘤脂質(zhì)代謝旺盛,表現(xiàn)出“生脂”表型或脂質(zhì)水解增多、脂肪酸攝取活躍。隨著腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)許多癌基因和抑癌基因參與代謝信號(hào)通路的調(diào)控。因此,癌基因、抑癌基因介導(dǎo)的代謝異�？赡苁荖AFLD發(fā)生及進(jìn)展為HCC的重要機(jī)制。ZHX2 (zinc fingers and homobox 2)屬于ZHX家族。該家族包括三個(gè)具有高度同源性的成員ZHX1、ZHX2和ZHX3。ZHX2蛋白能通過其HD1結(jié)構(gòu)域自身聚合形成同源二聚體,也可以與其同家族成員ZHX1或ZHX3以及轉(zhuǎn)錄因子NF-YA形成異源二聚體,發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄的功能。文獻(xiàn)及我們的前期研究顯示,ZHX2調(diào)控甲胎蛋白(a fetal protein, AFP)、Glypican-3 (GPC3)等重要HCC標(biāo)志物及細(xì)胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin E表達(dá),在肝癌中發(fā)揮抑癌基因作用。家族型高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化個(gè)體的遺傳分析發(fā)現(xiàn),ZHX2基因?yàn)楦咧Y易感基因,且ZHX2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血脂水平顯著升高,提示ZHX2與脂質(zhì)代謝異常相關(guān)。然而,ZHX2如何調(diào)控脂代謝,其機(jī)制如何?ZHX2調(diào)控脂代謝是否參與NAFLD,進(jìn)而通過調(diào)控脂代謝影響HCC發(fā)生,迄今尚未見報(bào)道。本課題擬深入研究ZHX2在非酒精性脂肪肝和肝細(xì)胞肝癌發(fā)生中的作用及其分子機(jī)制,并對其在改善腫瘤化療耐藥性中的作用進(jìn)行探討。第一部分ZHX2調(diào)控脂蛋白脂酶參與脂肪肝及肝細(xì)胞肝癌的作用及機(jī)制機(jī)體脂質(zhì)代謝復(fù)雜,涉及脂肪酸攝取、脂蛋白水解轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)合成、脂質(zhì)氧化及再利用等多個(gè)過程。相關(guān)研究提示ZHX2與血漿脂質(zhì)代謝異常相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期芯片結(jié)果顯示ZHX2表達(dá)與一系列脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)有相關(guān)性,脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase, LPL)就是其中之一。LPL是機(jī)體水解脂蛋白的關(guān)鍵酶,其生物學(xué)功能分為兩部分：一部分為甘油三酯的水解酶作用,可將血液中的乳糜微粒和極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,VLDL)所攜帶的甘油三酯水解,釋放的游離脂肪酸(Free fatty acid, FFA)可被細(xì)胞直接攝��；另一部分則是受體介導(dǎo)的脂蛋白內(nèi)吞作用的橋梁,可與脂蛋白殘粒附著、結(jié)合,介導(dǎo)細(xì)胞對脂蛋白殘粒的攝取。越來越多的研究顯示,LPL在乳腺癌、脂肪肉瘤等多種實(shí)體瘤中高表達(dá),并與這些腫瘤的預(yù)后差相關(guān),提示LPL參與腫瘤發(fā)生。然而,LPL是否參與ZHX2介導(dǎo)的脂代謝調(diào)控及ZHX2介導(dǎo)的腫瘤抑制作用,迄今尚不清楚。本課題擬從ZHX2對LPL的調(diào)控作用,探討ZHX2調(diào)控脂代謝及其在NAFLD和HCC中的作用及機(jī)制。一、ZHX2在多種肝癌細(xì)胞系中顯著抑制LPL表達(dá)為明確ZHX2對LPL表達(dá)的調(diào)控作用,分別進(jìn)行ZHX2過表達(dá)及siRNA干擾實(shí)驗(yàn)。利用脂質(zhì)體在ZHX2本底表達(dá)低的細(xì)胞系HepG2、BEL7402、HEK293中轉(zhuǎn)染ZHX2過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-ZHX2-HA, pcDNA3.0空載體為對照；在ZHX2本底表達(dá)高的細(xì)胞系SMMC7721、QSG7701細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染ZHX2siRNA, negtive control為對照。Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)和Western Blot (WB)檢測結(jié)果顯示,ZHX2過表達(dá)能夠明顯抑制不同細(xì)胞內(nèi)LPL的表達(dá),而干擾ZHX2, LPL表達(dá)顯著上調(diào)。以上結(jié)果說明ZHX2抑制LPL的表達(dá)。二、ZHX2通過Octamer位點(diǎn)負(fù)性調(diào)控LPL啟動(dòng)-子活性1.ZHX2顯著抑制LPL啟動(dòng)子活性首先構(gòu)建LPL全長啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3-LPLp (-1678～+67),分別與ZHX2過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和CHO細(xì)胞,與ZHX2 siRNA共轉(zhuǎn)染SMMC7721、QSG7701細(xì)胞。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示,ZHX2過表達(dá)能明顯抑制LPL啟動(dòng)子活性,而干擾ZHX2表達(dá),LPL啟動(dòng)子活性顯著升高。將不同劑量的ZHX2表達(dá)質(zhì)粒與相同劑量的LPL啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,雙熒光素酶報(bào)告檢測結(jié)果顯示,ZHX2對LPL啟動(dòng)子活性的抑制作用呈劑量依賴性。2.轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-96～-38nt是ZHX2抑制LPL啟動(dòng)子的關(guān)鍵片段為尋找ZHX2調(diào)控LPL啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵位點(diǎn),利用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件TFSEARCH分析LPL啟動(dòng)子中的轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn),據(jù)此構(gòu)建LPL系列截短啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒(上游分別為-981、-816、-666、-430、-196、-96、-38,下游均為+67)。將這些報(bào)告質(zhì)粒與ZHX2過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞系,檢測啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示,直到截短至-96-+67片段,ZHX2對其活性仍有很好的抑制作用,而只有啟動(dòng)子片段-38-+67不受ZHX2的影響。說明ZHX2在LPL啟動(dòng)子上的作用位點(diǎn)位于-96--38之間。3.ZHX2通過Octamer抑制LPL啟動(dòng)子活性根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的分布,重新構(gòu)建截短啟動(dòng)子-52～+67,共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示ZHX2仍舊對其活性有很好的抑制作用。TFSEARCH軟件分析顯示,LPL啟動(dòng)子-52～-38之間的重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)只有一個(gè),即Octamer。為驗(yàn)證其作用,設(shè)計(jì)突變引物,利用突變試劑盒將該區(qū)域的Octamer位點(diǎn)進(jìn)行突變,并構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pGL3-LPLp-96-Octamer-mutant。共轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示,突變LPL啟動(dòng)子-52--38間的Octamer位點(diǎn),ZHX2對LPL啟動(dòng)子活性的抑制作用消失,提示該區(qū)域Octamer位點(diǎn)是ZHX2調(diào)控LPL啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。為了進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)果,將含有野生型及突變的Octamer片段的LPL啟動(dòng)子區(qū)-46～-39片段克隆至pGL3-promoter載體。共轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示ZHX2能夠抑制含有野生型Octamer片段的啟動(dòng)子活性,而不能抑制Octamer位點(diǎn)突變的啟動(dòng)子活性。轉(zhuǎn)錄因子軟件TFSEARCH預(yù)測顯示與Octamer位點(diǎn)相鄰的-70～-65區(qū)域存在NF-YA的結(jié)合位點(diǎn)CCAAT。NF-YA是重要的LPL轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,且ZHX2能夠與NF-Y A結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。為研究NF-YA在ZHX2介導(dǎo)的LPL轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用,將NF-YA siRNA與pcDNA3.0-ZHX2-HA及LPL啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2田胞。結(jié)果顯示,干擾NF-YA表達(dá)不影響ZHX2對LPL啟動(dòng)子的抑制作用,提示NF-YA不參與ZHX2介導(dǎo)的LPL啟動(dòng)子活性調(diào)控。4. EMSA及ChIP實(shí)驗(yàn)顯示ZHX2能與LPL啟動(dòng)子Octamer位點(diǎn)結(jié)合為研究ZHX2與LPL啟動(dòng)子能否結(jié)合,將pcDNA3.0-ZHX2-HA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,提取核蛋白,進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)。對 HA抗體免疫沉淀后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,ZHX2能夠與含有 Octamer的LPL啟動(dòng)子-96～+67片段結(jié)合,但不能與不含有Octamer的-177--67片段結(jié)合。為進(jìn)一步研究ZHX2與Octamer的結(jié)合,分別用pcDNA3.0 及 pcDNA3.0-ZHX2-HA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,提取胞核蛋白。根據(jù)LPL啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)合成Octamer探針,凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)結(jié)果顯示,含ZHX2的核蛋白能與標(biāo)記探針很好的結(jié)合,該結(jié)合能被未標(biāo)記探針競爭性抑制,加入HA抗體的super shift實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了ZHX2蛋白能與Octamer序列的特異性結(jié)合。5. Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示ZHX2可以與轉(zhuǎn)錄因子Oct-1結(jié)合ZHX2含有與蛋白相互作用的HD1功能域。為研究ZHX2能否跟與Octamer結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Oct-1結(jié)合,用pcDNA3.0-ZHX2-HA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,提取細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行免疫共沉淀(Immunoprecipitation, IP)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,IP抗體ZHX2雜交的蛋白能夠與Oct-1結(jié)合,說明ZHX2能夠與轉(zhuǎn)錄因子Oct-1相互結(jié)合。三、ZHX2通過抑制LPL減輕肝癌細(xì)胞系及小鼠肝臟的脂肪變LPL是機(jī)體水解脂蛋白的限速酶,并介導(dǎo)肝細(xì)胞攝取脂蛋白,在多種脂代謝相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。ZHX2對LPL的調(diào)控作用提示ZHX2參與脂代謝相關(guān)疾病,為驗(yàn)證該假說,進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：1.ZHX2通過抑制LPL,減輕脂肪乳誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪變(1)脂肪乳誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變模型中ZHX2與LPL表達(dá)負(fù)相關(guān)首先檢測不同濃度脂肪乳對細(xì)胞活力的影響,用不含游離脂肪酸的但含不同濃度(0.2%、0.4%、0.8%、1%、2%)脂肪乳的1%BSA培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)72h內(nèi),0.4%及更小濃度的脂肪乳不會(huì)影響HepG2細(xì)胞活力。用不同濃度的脂肪乳(0.2%、0.4%、1%)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變,檢測細(xì)胞中ZHX2和LPL的表達(dá)變化與脂肪變程度的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著脂肪乳濃度的升高,細(xì)胞脂肪變程度增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)ZHX2表達(dá)降低而LPL的表達(dá)升高。(2)ZHX2抑制脂肪乳誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪沉積,LPL過表達(dá)逆轉(zhuǎn)上述過程將pEGFP-N1-ZHX2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,24h后加入0.4%脂肪乳。24h后,油紅O染色顯示脂質(zhì)沉積,DAPI染核。鏡下觀察,結(jié)果顯示,EGFP-ZHX2陽性細(xì)胞脂質(zhì)沉積明顯少于周圍細(xì)胞。提示,ZHX2抑制肝細(xì)胞脂肪沉積。為研究LPL在ZHX2抑制肝細(xì)胞脂肪變中的作用,構(gòu)建LPL過表達(dá)載體 pcDNA3.0-LPL-HA。將不同劑量的LPL過表達(dá)載體與ZHX2過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,然后用0.4%脂肪乳誘導(dǎo)脂肪變。48h后,超聲裂解細(xì)胞,化學(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞裂解液中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPL能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞的脂質(zhì)沉積,且共表達(dá)LPL和ZHX2的細(xì)胞,脂肪變的程度明顯比ZHX2單獨(dú)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞脂質(zhì)沉積多。說明LPL參與ZHX2抑制HepG2細(xì)胞脂肪變過程。2.ZHX2通過負(fù)調(diào)控LPL表達(dá)抑制小鼠肝臟脂肪變(1)脂肪肝小鼠模型肝組織中ZHX2表達(dá)顯著降低為進(jìn)一步研究ZHX2及LPL在脂肪肝中的可能作用,分別利用膽堿-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline-Deficient,MCD)飲食及高脂飲食(High-fat diet,HFD)誘導(dǎo)小鼠脂肪肝模型。抽提肝組織RNA,RT-PCR檢測Afrl(小鼠ZHX2)及LPL的表達(dá)。結(jié)果顯示,不論是哪種方式誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變,其肝內(nèi)Afrl的表達(dá)均明顯低于正常飲食組,相應(yīng)的LPL的表達(dá)均高于正常飲食組。提示,ZHX2調(diào)控LPL參與肝臟脂肪變。(2)干擾ZHX2促進(jìn)小鼠肝臟脂肪變?yōu)轵?yàn)證ZHX2在體內(nèi)參與肝臟脂肪變的作用,構(gòu)建針對Afrl的小干擾慢病毒Lenti-Virus-Afrl-shRNA,以每只小鼠3x10^7 TU慢病毒,10%體重(m1)的量,尾靜脈高壓注射C57BL/6小鼠,一周后MCD飼喂。每周稱體重,兩周后處死小鼠,稱肝重,肝臟大體拍照,肝勻漿液測TG。肝冰凍切片油紅O檢測脂質(zhì)沉積,并用IPP6.0分析脂質(zhì)沉積面積。肝石蠟切片做HE染色,觀察肝損傷。結(jié)果顯示,MCD成功誘導(dǎo)肝臟脂肪變,且干擾Afr1表達(dá)顯著加重MCD誘導(dǎo)的肝臟脂肪變。(3)過表達(dá)LPL逆轉(zhuǎn)ZHX2對MCD誘導(dǎo)小鼠脂肪肝的抑制作用為進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證LPL在ZHX2抑制肝脂肪變中的作用,尾靜脈高壓注射法分別將ZHX2過表達(dá)質(zhì)粒、LPL過表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)或聯(lián)合注入小鼠體內(nèi),每只小鼠60μg質(zhì)粒,注射體積同上。注射后2天進(jìn)行MCD飲食。每隔5天補(bǔ)注射一次質(zhì)粒。2周后處死小鼠,處理同上。結(jié)果顯示ZHX2過表達(dá)組脂肪變程度最輕,LPL過表達(dá)組最重,ZHX2與LPL聯(lián)合組介于兩者之間,即過表達(dá)LPL能顯著逆轉(zhuǎn)ZHX2對肝脂肪變的保護(hù)作用。說明LPL參與ZHX2抑制小鼠脂肪肝發(fā)生。四、ZHX2通過下調(diào)LPL表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)外生長文獻(xiàn)報(bào)道乳腺癌、脂肪肉瘤組織中LPL表達(dá)顯著增加,并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長。為研究LPL在ZHX2抑制HCC生長中的作用,進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：1.肝癌患者癌組織LPL表達(dá)明顯高于癌旁組織,且ZHX2與LPL表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)收集22例肝細(xì)胞肝癌及其對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本,提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR, Q-PCR)檢測LPL表達(dá)量。結(jié)果顯示HCC組織的LPL表達(dá)量明顯高于癌旁(p0.05)為了進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果,購買HCC組織芯片(含有75例患者癌和癌旁組織切片)。免疫組化結(jié)果顯示,癌組織LPL染色明顯強(qiáng)于癌旁組織。對染色結(jié)果進(jìn)行評分,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,LPL在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(p0.05)。為了驗(yàn)證HCC標(biāo)本中ZHX2對LPL表達(dá)的調(diào)控作用,選取肝癌臨床標(biāo)本及組織芯片標(biāo)本連續(xù)切片共97例,分別進(jìn)行ZHX2和LPL免疫組化染色。結(jié)果顯示：ZHX2表達(dá)與LPL表達(dá)存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系(p0.05),即LPL在高表達(dá)ZHX2的HCC中的表達(dá)顯著低于低表達(dá)ZHX2的HCC。2.LPL以脂質(zhì)依賴性方式顯著促進(jìn)HepG2肝癌細(xì)胞系的生長免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示HCC組織中LPL異常高表達(dá),并與抑癌基因ZHX2顯著負(fù)相關(guān),提示LPL參與HCC發(fā)生發(fā)展。為研究LPL對HCC生長的作用,用LPL過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染HepG2、SMMC7721、QSG7701細(xì)胞后,CCK-8法檢測細(xì)胞生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在含10%FCS的正常培養(yǎng)基培養(yǎng)情況下,LPL明顯促進(jìn)HCC細(xì)胞生長。醫(yī)用注射用脂肪乳類似于乳糜微粒,是醫(yī)院病房常備藥。此前,本課題用較高濃度(0.4%)脂肪乳誘導(dǎo)HepG2脂肪變。本實(shí)驗(yàn)設(shè)濃度梯度(0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、1%、2%)脂肪乳,培養(yǎng)72h。細(xì)胞活性檢測發(fā)現(xiàn),0.1%脂肪乳不僅不對肝細(xì)胞造成損傷,反而能夠補(bǔ)足1%BSA因?yàn)橹鞍兹狈υ斐傻募?xì)胞生長減緩。為驗(yàn)證脂蛋白對LPL促細(xì)胞生長作用的影響,分別在含10%小牛血清(Fetal calf serum, FCS)完全培養(yǎng)基、含1%BSA的培養(yǎng)基、及含1%BSA和0.1%脂肪乳的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),CCK-8檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示,完全培養(yǎng)基中LPL能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞生長。當(dāng)使用含1%BSA的培養(yǎng)基代替含10%FCS的正常培養(yǎng)基后,因?yàn)橹鞍缀陀坞x脂肪酸的缺乏,細(xì)胞生長明顯減慢,且LPL的促生長作用消失。3.LPL明顯改善ZHX2對肝癌細(xì)胞的生長抑制作用,該作用依賴于脂質(zhì)的存在為研究LPL在ZHX2抑制肝癌細(xì)胞生長中的作用,將LPL過表達(dá)質(zhì)粒與ZHX2過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后,分別在含1 0%FCS完全培養(yǎng)基、僅含1%BSA的培養(yǎng)基、及含1%BSA和0.1%脂肪乳的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),CCK-8檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示,完全培養(yǎng)基中LPL過表達(dá)顯著破壞ZHX2對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用,而撤除脂質(zhì)(1%BSA培養(yǎng)基),該作用消失,添加0.1%脂肪乳后LPL對ZHX2抑癌作用的逆轉(zhuǎn)作用恢復(fù)。4.LPL能夠逆轉(zhuǎn)ZHX2對荷瘤小鼠體內(nèi)H22肝癌細(xì)胞生長的抑制作用為驗(yàn)證LPL體內(nèi)逆轉(zhuǎn)ZHX2抑制肝癌細(xì)胞生長的作用,取腹腔活化的腹水瘤H22細(xì)胞2x10∧7/ml,按照100ul/只小鼠,皮下注射建立荷瘤小鼠。3天后,瘤徑約3-5mm時(shí),按照20μg/100μl量,瘤內(nèi)注射質(zhì)粒：pcDNA3.0, pcDNA3.0-ZHX2-HA, pcDNA3.0-LPL-HA, pcZHX2+pcLPL。每隔兩天測瘤徑及瘤內(nèi)注射質(zhì)粒。15天后,殺鼠取瘤,稱瘤重,拍照。結(jié)果顯示,LPL過表達(dá)顯著促進(jìn)荷瘤鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞生長,且LPL過表達(dá)有效逆轉(zhuǎn)ZHX2對荷瘤鼠體內(nèi)HCC的抑制作用。綜上,本研究通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及臨床標(biāo)本檢測,首次闡明ZHX2對LPL轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控的分子機(jī)制并首次報(bào)道LPL在HCC癌組織的異常高表達(dá)及其促HCC生長作用。研究表明ZHX2作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,除了已知的對癌基因和周期蛋白的抑制之外,還可通過對脂代謝重要酶LPL的轉(zhuǎn)錄抑制,從而抑制肝細(xì)胞脂肪沉積,延緩脂肪肝的發(fā)生,并通過抑制LPL介導(dǎo)的脂肪攝取及累積抑制HCC生長。第二部分ZHX2通過下調(diào)MDR1增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂代謝異�；钴S,大量合成或攝取的脂肪酸一方面為腫瘤細(xì)胞生長供能,一方面形成腫瘤細(xì)胞中富含飽和脂肪酸的生物膜系統(tǒng),使腫瘤細(xì)胞更能耐受射線損傷及藥物的毒性作用,成為腫瘤耐藥的機(jī)制之一。臨床研究發(fā)現(xiàn),骨髓瘤患者ZHX2表達(dá)與患者的藥物耐受性顯著相關(guān),提示ZHX2在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用。P蛋白(又稱為腫瘤多藥耐藥蛋白1, Multidrug resistance 1, MDR1)不僅能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外,導(dǎo)致多種腫瘤耐藥,還能將飲食來源的膽固醇泵入胞內(nèi)。其啟動(dòng)子區(qū)存在NF-Y結(jié)合位點(diǎn),并且NF-YA能夠正調(diào)控MDR1啟動(dòng)子活性。本課題設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究ZHX2能否通過對MDR1的調(diào)控達(dá)到改善HCC及肺癌細(xì)胞化療敏感性的效果。一、ZHX2顯著增強(qiáng)不同腫瘤細(xì)胞的化療敏感性1.ZHX2表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞化療敏感性相關(guān)本實(shí)驗(yàn)首先用肝癌細(xì)胞系和肺癌細(xì)胞系同時(shí)驗(yàn)證化療藥物順鉑(CDDP)對細(xì)胞的毒性。結(jié)果顯示,ZHX2內(nèi)源性表達(dá)高的細(xì)胞系(SMMC7721, A549), CDDP對細(xì)胞的抑制率高,提示ZHX2可能會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。2.ZHX2增強(qiáng)肝癌及肺癌細(xì)胞系對順鉑及阿霉素的敏感性將不同的細(xì)胞系分別轉(zhuǎn)染ZHX2的過表達(dá)質(zhì)粒和siR,NA后,加入不同濃度的CDDP和阿霉素(ADM),24h后,CCK-8檢測細(xì)胞存活率,并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值。結(jié)果顯示：ZHX2過表達(dá)組IC50值顯著低于pcDNA3.0對照組；而相對陰性對照(Negative control,NC)組,ZHX2 siRNA組(ZHX2-1674,ZHX2-2360)IC50值均明顯升高。上述結(jié)果顯示,ZHX2可以改善腫瘤細(xì)胞對CDDP.ADM的耐藥性。3.ZHX2促進(jìn)CDDP介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,選取耐藥性較高的細(xì)胞系HepG2,過表達(dá)ZHX2后,用CDDP(20ug/ml,24h)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用AnnexinV-PI標(biāo)記凋亡細(xì)胞,流式檢測各組細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,ZHX2聯(lián)合CDDP組細(xì)胞早期凋亡最多,說明ZHX2能夠增強(qiáng)化療藥物CDDP對HepG2細(xì)胞的損傷。二、ZHX2負(fù)向調(diào)控不同腫瘤細(xì)胞系中MDRl表達(dá)MDR1是與腫瘤多藥耐藥性密切相關(guān)的基因,且其啟動(dòng)子區(qū)NF-Y結(jié)合位點(diǎn)的存在提示我們此基因極有可能也被ZHX2所調(diào)控。為了驗(yàn)證ZHX2對MDR1表達(dá)的抑制作用,分別將ZHX2過表達(dá)載體和ZHX2 siRNAs轉(zhuǎn)染入不同細(xì)胞系。RT-PCR及WB結(jié)果顯示,ZHX2過表達(dá)明顯抑制肝癌及肺癌細(xì)胞系中MDR1表達(dá)；而用ZHX2 siRNAs干擾ZHX2,不同腫瘤細(xì)胞中MDR1的表達(dá)均明顯上調(diào)。三、ZHX2顯著抑制不同腫瘤細(xì)胞中的MDR1藥物泵功能MDRl又被稱為P蛋白,可以以ATP依賴性方式將包括化療藥物在內(nèi)的多種物質(zhì)選擇性泵出細(xì)胞外。為驗(yàn)證ZHX2對MDR1藥物泵的抑制作用,分別將pEGFP-N1-ZHX2轉(zhuǎn)染HepG2和SPC-A-1細(xì)胞,24h后,加入40μg/ml ADM.作用4h后,DAPI染核。鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)ZHX2陽性細(xì)胞內(nèi)ADM含量明顯高于周圍其他細(xì)胞。將pEGFP-N1-ZHX2轉(zhuǎn)染HepG2,24h后,加入40μg/ml ADM。一組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2h,待檢測藥物富集；另一組細(xì)胞換成不含ADM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)2h,待檢測藥物潴留,最后計(jì)算藥物釋放指數(shù)。流式結(jié)果顯示,EGFP陽性細(xì)胞群ADM富集多,潴留多,釋放少。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ZHX2可以顯著抑制藥物外流從而增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。四、ZHX2通過影響NF-YA與MDR1啟動(dòng)子相應(yīng)元件結(jié)合抑制MDR1轉(zhuǎn)錄1.ZHX2劑量依賴性抑制MDR1啟動(dòng)子活性ZHX2具有轉(zhuǎn)錄抑制活性。為研究ZHX2對MDR1啟動(dòng)子活性的抑制作用,分別將ZHX2過表達(dá)載體或ZHX2 siRNAs與MDR1啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染不同的腫瘤細(xì)胞系。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示,增強(qiáng)ZHX2表達(dá)能顯著抑制MDR1啟動(dòng)子活性,而干擾ZHX2能顯著增強(qiáng)MDR1啟動(dòng)子活性,且均呈劑量依賴性。2.ZHX2以NF-YA依賴性方式抑制MDR1轉(zhuǎn)錄活性在MDR1野生型啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Mp的基礎(chǔ)上,構(gòu)建ATTGG元件突變的MDR1啟動(dòng)子載體pGL3-mMp,并將這兩種載體分別與ZHX2過表達(dá)載體或pcDNA3.0共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,檢測ZHX2對啟動(dòng)子活性的影響。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示,NF-YA結(jié)合位點(diǎn)突變后,ZHX2對啟動(dòng)子活性的抑制作用消失。與此相一致,將NF-YA siRNA、ZHX2過表達(dá)質(zhì)粒及MDR1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)干擾NF-YA表達(dá)后ZHX2對MDR1啟動(dòng)子的抑制作用消失。3.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí),腫瘤細(xì)胞中ZHX2能與NF-YA結(jié)合為了確認(rèn)ZHX2與NF-YA的相互作用,將ZHX2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。48小時(shí)后裂解細(xì)胞,用NF-YA抗體及同型對照IgG作為IP抗體。免疫沉淀后的蛋白,用ZHX2抗體和NF-YA抗體進(jìn)行WB。結(jié)果顯示與NF-YA抗體結(jié)合的蛋白也能與ZHX2抗體結(jié)合,即ZHX2與NF-YA結(jié)合。4.ZHX2干擾NF-YA與MDR1啟動(dòng)子的結(jié)合為進(jìn)一步研究ZHX2對MDR1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,分別在HepG2細(xì)胞和SPC-A-1細(xì)胞中過表達(dá)ZHX2,將ZHX2過表達(dá)蛋白分別與NF-YA 、 HA抗體孵育,按照前面的方法進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)ZHX2及NF-YA均能與MDR1啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合,且ZHX2過表達(dá)明顯減弱NF-YA與MDR1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),含CCAAT原件的探針能夠與過表達(dá)ZHX2的HepG2細(xì)胞核蛋白結(jié)合。上述結(jié)果提示,ZHX2通過與NF-YA相互競爭CCAAT位點(diǎn)而抑制MDR1啟動(dòng)子活性。五、腫瘤組織標(biāo)本檢測顯示耐藥基因MDRl與ZHX2表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系為在臨床標(biāo)本中驗(yàn)證ZHX2對MDR1的調(diào)控作用,收集30例HCC臨床標(biāo)本和54例肺癌(其中肺鱗癌33例,肺腺癌21例)臨床標(biāo)本,免疫組化檢測ZHX2和MDR1表達(dá),評分后統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其相關(guān)性。結(jié)果顯示,無論是肝癌組織還是肺癌組織,ZHX2表達(dá)均與MDR1表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)(肝癌,p0.05；肺癌,p0.001),即MDR1低表達(dá)腫瘤組織中ZHX2表達(dá)量明顯高于MDR1高表達(dá)組(肝癌,p0.05；肺癌,p0.01)。綜上所述,ZHX2可通過轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控MDR1,降低肝癌及肺癌的多藥耐藥性。ZHX2調(diào)控MDR1可能的分子機(jī)制是通過與NF-YA相互競爭CCAAT位點(diǎn)而導(dǎo)致MDR1啟動(dòng)子活性的降低。本研究提示ZHX2可增強(qiáng)腫瘤的化療敏感性,為腫瘤的基因治療又添有力證據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.5;R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 David Yiu-Kuen But;Ching-Lung Lai;Man-Fung Yuen;;Natural history of hepatitis-related hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2008年11期

本文編號(hào)：2778338