【摘要】：前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,隨著人口老齡化的加劇,前列腺癌的發(fā)病率和死亡率也逐年增高。前列腺癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移,且轉(zhuǎn)移后預(yù)后較差。在治療方面,早期前列腺癌主要以手術(shù)治療為主,若手術(shù)治療后復(fù)發(fā)或前列腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移,則以內(nèi)分泌治療為主。有研究表明早期雄激素剝奪治療對(duì)80%的患者敏感,此時(shí)大多為激素依賴性前列腺癌(androgen-dependent prostate cancer,ADPC),在經(jīng)過14-30個(gè)月的中位時(shí)間后,最終都發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC),此階段的前列腺癌對(duì)各種治療都不敏感,是晚期患者死亡的主要原因�，F(xiàn)已有很多關(guān)于前列腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移方面的研究,但其原因及機(jī)制目前仍未完全了解清楚。近年來,越來越多關(guān)于microRNA(miRNA)和腫瘤之間相關(guān)性的研究。miRNA是單鏈的非編碼小分子RNA,含有19-25個(gè)核苷酸,通過結(jié)合編碼基因的mRNA的3’非編碼區(qū)(3’UTR)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達(dá),已有大量的研究表明miRNA和細(xì)胞的增殖、凋亡有著密不可分的關(guān)系。通過結(jié)合基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)和臨床相關(guān)性研究分析,我們發(fā)現(xiàn)miR-200a在ADPC和CRPC組織中的表達(dá)存在差異,CRPC組織中miR-200a相對(duì)ADPC組織顯著低表達(dá)。miR-200a是miR-200家族中的一員,在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)miR-200a表達(dá)異常,但是miR-200a與前列腺癌關(guān)系的研究目前僅國(guó)外有少數(shù)報(bào)道,故本研究首先通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在前列腺癌的組織中驗(yàn)證miR-200a的表達(dá)水平,并且通過miR-200a表達(dá)失調(diào)的體外功能實(shí)驗(yàn),探究miR-200a在前列腺癌中的生物學(xué)功能。最后通過Agilent(人類)表達(dá)譜芯片檢測(cè)和預(yù)測(cè)網(wǎng)站相結(jié)合的辦法進(jìn)一步探究miR-200a潛在的下游靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證,為篩選前列腺癌的生物標(biāo)志物以及今后尋找新的前列腺癌治療靶點(diǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。第一部分miR 200a在前列腺癌組織中的表達(dá)差異目的:前列腺癌的發(fā)生是一個(gè)很復(fù)雜的過程,涉及到許多不同的基因。為了尋找可能影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的miRNA,本階段研究通過miRNAs芯片表達(dá)譜檢測(cè)分析在ADPC患者組織標(biāo)本與CRPC癌患者組織標(biāo)本中顯著差異性表達(dá)的miRNA,結(jié)合文獻(xiàn)選取有研究意義的miRNA,并予以驗(yàn)證。方法:臨床收集8例ADPC組織與6例CRPC組織在液氮中保存,取3例ADPC組織與3例CRPC組織進(jìn)行miRNAs表達(dá)譜芯片檢測(cè)分析,結(jié)合文獻(xiàn)尋找有研究意義的miRNA,并且進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)實(shí)驗(yàn),在組織標(biāo)本中驗(yàn)證其表達(dá)量。同時(shí),下載美國(guó)紀(jì)念斯隆凱瑟琳癌癥研究中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center,MSKCC)數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌患者的miRNA表達(dá)基因芯片數(shù)據(jù),利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法分析差異表達(dá)的miRNA在前列腺癌中的診斷作用以及與前列腺癌生化復(fù)發(fā)的關(guān)系。結(jié)果:miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)在ADPC與CRPC組織中miR-200a的表達(dá)存在顯著差異。miR-200a在惡性程度較高的CRPC組織中與ADPC組織相比顯著低表達(dá),并且在前列腺癌組織標(biāo)本中進(jìn)行q RT-PCR實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了這一點(diǎn)(P0.001)。同時(shí),對(duì)MSKCC數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的前列腺癌患者資料進(jìn)行二次分析,以中位數(shù)為截點(diǎn)將前列腺癌組分為miR-200a高表達(dá)組和miR-200a低表達(dá)組進(jìn)行Kaplan Meier分析,結(jié)果顯示miR-200a低表達(dá)組的患者生化復(fù)發(fā)時(shí)間似乎比miR-200a高表達(dá)組短,但是無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。通過多因素COX回歸分析得出miR-200a是影響前列腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論:通過研究結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)miR-200a在CRPC中的表達(dá)較ADPC中顯著降低,并且miR-200a能夠用于輔助診斷前列腺癌的惡性進(jìn)展。第二部分miR 200a對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及機(jī)制初探目的:在第一部分中,我們通過miRNA芯片表達(dá)譜分析結(jié)合q RT-PCR驗(yàn)證了miR-200a在CRPC組織中顯著低表達(dá),并且miR-200a是影響前列腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為了進(jìn)一步探究miR-200a可能對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能造成哪些影響以及產(chǎn)生影響的機(jī)制,本部分研究采用過表達(dá)前列腺癌細(xì)胞中miR-200a的方法,進(jìn)行凋亡、侵襲、遷移和平板細(xì)胞克隆形成等實(shí)驗(yàn),研究分析miR-200a對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響并尋找miR-200a的下游靶基因,進(jìn)一步了解miR-200a和前列腺癌之間的關(guān)系。方法:分別在兩種雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞(DU145、PC3)中過表達(dá)miR-200a,將過表達(dá)組與陰性對(duì)照組進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)和低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn),觀察miR-200a對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響;Transwell小室侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)觀察miR-200a對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響;進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)并使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)凋亡率,觀察miR-200a對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響。使用Agilent(人類)表達(dá)譜芯片檢測(cè)和miRNA靶基因分析和預(yù)測(cè)軟件(miRNADA、Target Scan、Array、Diana)篩選miR-200a的潛在下游靶基因,并通過Western Blot實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來驗(yàn)證。結(jié)果通過SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和低密度細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)均表明過表達(dá)miR-200a組細(xì)胞和陰性對(duì)照組(negative control組)相比,過表達(dá)組能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖能力(P0.05);Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)miR-200a后前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低(P0.05);使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-200a后能增加前列腺癌細(xì)胞的凋亡率(P0.05)。通過Agilent(人類)表達(dá)譜芯片檢測(cè)和miRNA靶基因分析和預(yù)測(cè)軟件結(jié)合的方法,我們發(fā)現(xiàn)溴樣結(jié)構(gòu)域蛋白4(BRD4)是miR-200a的潛在下游靶基因,并且Western Blot實(shí)驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-200a可以結(jié)合到BRD4的3’UTR區(qū)使得BRD4蛋白的表達(dá)量下降(P0.05)。結(jié)論:試驗(yàn)證明了過表達(dá)miR-200a后,前列腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖能力均受到抑制,并能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡,故能得出結(jié)論,miR-200a在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演的是抑癌基因的角色,并且BRD4是miR-200a的潛在下游靶基因,miR-200a可能通過靶向BRD4來影響前列腺癌細(xì)胞的生物功能。
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.25
【圖文】：

圖 1.1 excel 表格表示 miRNA 在 ADPC 組織和 CRPC 組織中的差異表達(dá)隨機(jī)選取液氮中保存的 3 例 ADPC 組織和 3 例 CRPC 組織，采用 AgilentmiRNAs 表達(dá)譜芯片，委托上海吉?jiǎng)P生物公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析。檢測(cè)結(jié)果顯示 miR-200a 在 CRPC 中與 ADPC 相比明顯降低。2.miR-200a 與前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)時(shí)間的關(guān)系

表明 miR-200a 在 CRPC 組織中的表達(dá)低于與 A 1.1 excel 表格表示 miRNA 在 ADPC 組織和 CRPC 組織中的差異取液氮中保存的 3 例 ADPC 組織和 3 例 CRPC 組織，譜芯片，委托上海吉?jiǎng)P生物公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)200a 在 CRPC 中與 ADPC 相比明顯降低。a 與前列腺癌患者生化復(fù)發(fā)時(shí)間的關(guān)系

T-PCR 驗(yàn)證 miR-200a 在 ADPC 組織和 CRPC 組織中將剩余的前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行熒光定量 PCR 組織中的表達(dá)和 ADPC 中相比明顯降低，中扮演的是抑癌基因的角色（P < 0.001）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓蘇軍;張思維;陳萬青;李長(zhǎng)嶺;;中國(guó)前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢(shì)分析[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2013年04期

本文編號(hào)：2777645