【摘要】：隨著目前對(duì)癌前病變及胃癌診治水平的提高,發(fā)達(dá)國(guó)家胃癌的總體發(fā)病率和死亡率較前有所下降,但胃癌依然是全球尤其是東南亞國(guó)家高發(fā)的惡性腫瘤之一。目前認(rèn)為胃癌的發(fā)生、發(fā)展與某些癌基因的激活和/或抑癌基因的失活密切相關(guān),基于此理論發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證新的癌基因不僅能夠?yàn)殛U明胃癌可能的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ),還有助于發(fā)現(xiàn)新的用于胃癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。膜聯(lián)蛋白家族(Annexins,ANXs)是廣泛表達(dá)于除酵母之外的真核細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+調(diào)節(jié)磷脂結(jié)合蛋白,其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜蛋白與其他位于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞核膜和細(xì)胞外基質(zhì)之間蛋白的相互作用而發(fā)揮作用。膜聯(lián)蛋白家族共有A、B、C、D和E五個(gè)亞組,A組主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞,包括12個(gè)成員(A1-A11、A13)。近年來研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A11(ANXA11)與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有著密切聯(lián)系,在細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)過程中起著重要作用。ANXA11的表達(dá)水平在卵巢癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、慢性粒細(xì)胞白血病、胃癌和肝癌中都存在異常。然而,目前關(guān)于ANXA11在腫瘤發(fā)生發(fā)展中更加深入的研究數(shù)量相對(duì)較少,而在胃癌中可能的作用機(jī)制也不明確。本研究以人胃癌組織、不同分化的人胃癌細(xì)胞株和通過構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤為研究對(duì)象。分別應(yīng)用常規(guī)HE病理染色、免疫組織化學(xué)、蛋白印跡法(Western Blot)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q PCR)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell小室等實(shí)驗(yàn)方法首先研究了胃癌及癌旁正常組織中ANXA11 m RNA和蛋白的表達(dá)差異,并分析ANXA11的表達(dá)水平與胃癌患者各項(xiàng)臨床和病理數(shù)據(jù)的關(guān)系;然后通過體外實(shí)驗(yàn)研究抑制ANXA11后對(duì)胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901各種生物學(xué)行為(如細(xì)胞增殖、遷移和侵襲)的影響,最后通過構(gòu)建能穩(wěn)定抑制ANXA11的AGS細(xì)胞株后觀察其在體內(nèi)對(duì)裸鼠皮下移植瘤增殖的影響,探討了ANXA11在胃癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用,從而為更深刻的認(rèn)識(shí)和研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)和方向。第一部分胃癌中膜聯(lián)蛋白A11的表達(dá)及與其臨床生物學(xué)特性關(guān)系的研究目的:驗(yàn)證ANXA11在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá),以及與胃癌患者各項(xiàng)臨床和病理參數(shù)的關(guān)系。方法:1 q PCR、Western Blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)63例配對(duì)的胃癌組織和癌旁正常胃組織中ANXA11 m RNA和蛋白的表達(dá)水平。2分析ANXA11表達(dá)水平與胃癌患者各項(xiàng)臨床和病理參數(shù)的關(guān)系。3 q PCR和Western Blot檢測(cè)4株胃癌細(xì)胞和GES-1細(xì)胞中ANXA11的表達(dá)水平。結(jié)果:1.q PCR、Wester Blot和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:ANXA11在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,差異具有顯著性(P0.05)。2.ANXA11表達(dá)上調(diào)與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤部位和Borrmann分型無關(guān),而與腫瘤大小、浸潤(rùn)程度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及有無血管侵犯顯著相關(guān)(P0.05)。3.與GES-1相比,AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株中ANXA11表達(dá)升高(P0.05),而其它2株常見的胃癌細(xì)胞株MGC-803和BGC-823中ANXA11表達(dá)與GES-1未見明顯差異。小結(jié):1.ANXA11在胃癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。2.ANXA11表達(dá)水平的升高與胃癌患者的腫瘤大小、浸潤(rùn)程度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及有無血管侵犯顯著相關(guān),可能成為胃癌的腫瘤標(biāo)志物之一。3.ANXA11 m RNA和蛋白在AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株上高表達(dá),適合體外構(gòu)建抑制ANXA11的細(xì)胞株。第二部分抑制膜聯(lián)蛋白A11對(duì)胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901增殖、遷移及侵襲能力的影響目的:研究抑制ANXA11對(duì)胃癌細(xì)胞AGS和SGC-7901增殖、遷移及侵襲能力的影響。方法:1構(gòu)建能有效抑制ANXA11的AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株;2平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察抑制ANXA11后對(duì)AGS和SGC-7901細(xì)胞克隆形成和增殖的影響;3采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抑制ANXA11對(duì)AGS和SGC-7901細(xì)胞周期的影響。4細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)研究抑制ANXA11后對(duì)AGS和SGC-7901細(xì)胞遷移和侵襲的影響并利用Western Blot檢測(cè)抑制AXNA11后對(duì)遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。5 Western Blot檢測(cè)抑制ANXA11后對(duì)AGS和SGC-7901細(xì)胞株AKT/GSK-3β/Cyclin D1信號(hào)通路的影響。結(jié)果:1.RT-PCR、q PCR結(jié)果顯示與NC組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的ANXA11-m RNA表達(dá)水平明顯降低,以si RNA1在40n M濃度下效果最為明顯。Western Blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的ANXA11蛋白表達(dá)水平較NC組細(xì)胞明顯降低,同樣是以si RNA1在40n M濃度下效果最為明顯(P0.05)。2.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制ANXA11后轉(zhuǎn)染組胃癌細(xì)胞形成克隆的數(shù)量明顯少于NC組和空白對(duì)照組。CCK-8結(jié)果顯示NC組和轉(zhuǎn)染組在第0h和第24h的吸光度值(OD值)沒有顯著差異,而在第48h、第72h和第96h時(shí)轉(zhuǎn)染組OD值較NC組顯著降低(P0.05)。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示抑制ANXA11表達(dá)后,轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞較NC組明顯增加(P0.05)。4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與NC組相比,ANXA11轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的平面遷移活性受到明顯抑制(P0.05)。5.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抑制ANXA11后AGS和SGC-7901細(xì)胞通過Transwell小室基質(zhì)膠的貼壁細(xì)胞明顯少于NC組(P0.05)。6.抑制ANXA11后轉(zhuǎn)染組MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平較NC組明顯下調(diào)(P0.05)。7.抑制ANXA11后轉(zhuǎn)染組和NC組相比AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、PCNA和Cyclin D1蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)水平均明顯降低(P0.05)。小結(jié):1.成功構(gòu)建出能有效抑制ANXA11的AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株。2.抑制ANXA11可明顯抑制AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖,導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期3.抑制ANXA11后能夠抑制AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,可能與下調(diào)MMP-2和MMP-9水平有關(guān)。4.抑制ANXA11后AGS和SGC-7901細(xì)胞內(nèi)AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Cyclin D1和PCNA蛋白表達(dá)都不同程度有所降低,因此ANXA11調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖可能部分通過AKT/GSK-3β/Cyclin D1信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。第三部分抑制膜聯(lián)蛋白A11對(duì)胃癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)影響的研究目的:研究抑制ANXA11在體內(nèi)對(duì)裸鼠皮下移植瘤增殖的影響。方法:1構(gòu)建能穩(wěn)定抑制ANXA11的AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株,進(jìn)行裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn),并觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況。2應(yīng)用Western Blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)裸鼠移植瘤組織ANXA11和Ki-67的表達(dá)情況。結(jié)果:1.經(jīng)過熒光顯微鏡下篩選,在MOI分別為50和100的情況下AGS和SGC-7901細(xì)胞感染陽(yáng)性率達(dá)到80%以上,后經(jīng)RT-PCR和q PCR驗(yàn)證,與空載體轉(zhuǎn)染組相比,ANXA11-si RNA轉(zhuǎn)染組中AXNA11的表達(dá)水平明顯降低,差異具有顯著性(P0.05)。2.兩組細(xì)胞于接種5天后均可形成肉眼可見的瘤體。生長(zhǎng)曲線圖顯示ANXA11-si RNA轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤較空載體轉(zhuǎn)染組生長(zhǎng)明顯減慢,于3周時(shí)差異具有顯著性�？蛰d體組裸鼠移植瘤的平均瘤重為1.52士0.23g;ANXA11-si RNA轉(zhuǎn)染組移植瘤的平均瘤重為0.66士0.19g,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析空載體轉(zhuǎn)染組移植瘤的平均重量高ANXA11-si RNA轉(zhuǎn)染組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.Western Blot和免疫組化結(jié)果顯示ANXA11-si RNA轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞中ANXA11和Ki-67的表達(dá)顯著降低(P0.05)。小結(jié):1.成功構(gòu)建能穩(wěn)定抑制ANXA11的AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株。2.成功構(gòu)建AGS細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。3.抑制ANXA11表達(dá)后可使裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制,重量減輕。4.抑制ANXA11后移植瘤中ANXA11和Ki-67表達(dá)水平降低,說明胃癌細(xì)胞的增殖活性降低。結(jié)論1.ANXA11在胃癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)且與患者腫瘤大小、浸潤(rùn)程度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及有無血管侵犯顯著相關(guān);在AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株中ANXA11表達(dá)高于GES-1。2.抑制ANXA11能在體外顯著抑制AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞的增殖、并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯3.抑制ANXA11能在體外顯著抑制AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,可能與下調(diào)MMP-2和MMP-9水平有關(guān)。4.ANXA11調(diào)控細(xì)胞增殖可能部分通過AKT/GSK-3β/Cyclin D1信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)5.抑制ANXA11后能顯著抑制人胃癌細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤的增殖。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2
【圖文】：
圖 2 ANXA11 蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig. 2 The expression ofANXA11 protein in gastric cancer tissues weredetected by western blot(A) and immunohistochemistry(B).(b,d: adjacent mucosa tissues; a,c: gastric carcinoma tissues)
A11 在不同胃癌細(xì)胞株和永生化的正常胃黏膜pression level ofANXA11 in gastric epithelial cenes by qPCR (A) and western blot (B). （compar*P<0.05）
51 2 不同濃度 ANXA11-siRNA1 轉(zhuǎn)染后人胃癌細(xì)胞株 SGC-7901 和 A后細(xì)胞中 ANXA11 蛋白的表達(dá)ig. 2 Dose-dependent silencing ofANXA11 by SGC-7901 andAGS ceere treated with ANXA11-siRNA1 at the indicated concentrations of 1，80 nM，60 nM，40 nM, 20 nM or NC at the concentration of 40 nMithout treatment. (A, B): SGC-7901, (C, D):AGS *P<0.05 compared wNC group.
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2776299
