發(fā)布時(shí)間：2020-07-28 12:27

【摘要】：人類(lèi)T淋巴細(xì)胞白血病I型病毒(HTLV-1)是成人T淋巴細(xì)胞白血病(ATL)的致病病原。研究證實(shí),HTLV-1通過(guò)其自身編碼的病毒蛋白參與宿主細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié),影響腫瘤細(xì)胞的增殖與ATL的發(fā)生。臨床檢測(cè)報(bào)道顯示,在ATL中Notch1通路異常激活,且抑制Notch1介導(dǎo)的信號(hào)通路能夠顯著抑制ATL細(xì)胞的增殖與腫瘤的形成。RBPJ作為Notch1信號(hào)通路中一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,在Notch1信號(hào)通路的激活中發(fā)揮重要作用。然而迄今,RBPJ參與的Notch1信號(hào)通路在ATL發(fā)生過(guò)程中的作用與機(jī)制尚不清楚。為了探索RBPJ在ATL中的表達(dá)及其作用,本研究將從分子、細(xì)胞以及動(dòng)物水平探究RBPJ在ATL細(xì)胞增殖與遷移中的作用,揭示RBPJ影響ATL細(xì)胞增殖與遷移的分子機(jī)制。本研究的主要內(nèi)容如下:第一部分:探討RBPJ在HTLV-1感染細(xì)胞株中表達(dá)與調(diào)控機(jī)制采用Real-time PCR技術(shù)與蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)HTLV-1感染陰性與陽(yáng)性細(xì)胞中RBPJ表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)RBPJ在HTLV-1感染陽(yáng)性細(xì)胞中普遍高表達(dá);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),ATL中RBPJ的表達(dá)與病毒蛋白p30表達(dá)呈明顯正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在HTLV-1感染細(xì)胞中,RBPJ的過(guò)表達(dá)可能受病毒蛋白p30表達(dá)的調(diào)控。第二部分:研究RBPJ在ATL細(xì)胞增殖與遷移中的作用以HTLV-1陽(yáng)性細(xì)胞株ATL-T為研究材料,建立RBPJ沉默穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,采用Real-time PCR與Western blot方法檢測(cè)RBPJ沉默效果與病毒蛋白的表達(dá),實(shí)驗(yàn)顯示沉默ATL細(xì)胞中RBPJ的表達(dá)并不影響病毒核心抗原的表達(dá)。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖與周期分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默RBPJ后細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制,且細(xì)胞周期主要阻滯在G1期。Trans-well檢測(cè)結(jié)果顯示,沉默ATL細(xì)胞中RBPJ后,細(xì)胞遷移能力明顯下降。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí),沉默RBPJ的表達(dá)能夠顯著抑制ATL細(xì)胞的小鼠皮下成瘤效果。第三部分:探究RBPJ影響ATL細(xì)胞增殖與遷移的分子機(jī)制采用Real-time PCR與Western blot檢測(cè)沉默穩(wěn)定株中,周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)與EMT途徑中基因與蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)沉默ATL細(xì)胞中RBPJ后,細(xì)胞周期依賴的激酶4、6,細(xì)胞周期蛋白D2、D3、E1以及磷酸化Rb的表達(dá)明顯降低;EMT途徑中E-Cadherin表達(dá)升高,而TCF-8,Snail,N-Cadherin,β-Catenin等蛋白表達(dá)下降;同樣,這些基因的表達(dá)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到相同結(jié)果。綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)HTLV-1的病毒蛋白p30通過(guò)激活RBPJ的表達(dá),并影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白與EMT家族蛋白表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致ATL的發(fā)生。本研究揭示了RBPJ在ATL發(fā)生過(guò)程中的調(diào)控作用,初步闡明了RBPJ影響細(xì)胞增殖與遷移的可能分子機(jī)制。為人們更好的認(rèn)識(shí)ATL的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù),為HTLV-1感染類(lèi)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R733.7
【圖文】：

感染者的發(fā)病率僅有 5%，但是由于死亡率高和預(yù)后差，并且目前沒(méi)有有效的療方案使得 HTLV-1 已經(jīng)嚴(yán)重危害著人們的生命。自 1977 日本學(xué)者 Bethesda次報(bào)道 HTLV-1 感染者以來(lái)，全球 HTLV-1 感染者的人數(shù)突破 2000 萬(wàn)，而亞地區(qū)成為 HTLV-1 感染的高發(fā)區(qū)[2, 3]。我國(guó)學(xué)者先后于十多個(gè)東南沿海的省市現(xiàn) HTLV-1 感染患者[4-11]。并且在福建、廣東及臺(tái)灣等地區(qū)呈現(xiàn)出流行性。目由于人口的流動(dòng)性增加將導(dǎo)致 HTLV-1 的感染者逐年增多[6, 12]。HTLV-1 為二十面體的球型結(jié)構(gòu)，外面為病毒的衣殼，里面為 RNA 和蛋白組成的核心顆粒，直徑約為 100nm。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒一樣，HTLV-1 前病毒因組由兩端的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR），Gag、Pol、Env 三個(gè)結(jié)構(gòu)基因和 px 區(qū)構(gòu)成。px 區(qū)域正向編碼 Tax、Rex、p30、p21、和 pP8 及反向編碼的 HBZ 等調(diào)蛋白 (如圖 1.1)[1]。這些病毒編碼的調(diào)控蛋白能夠調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)的諸如 AP1，-κB，CREB 等信號(hào)通通路，在 HTLV-1 感染，細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳播，病毒潛伏感染，病毒基因的復(fù)制及 ATL 及 HAN/TSP 等疾病的發(fā)生中均發(fā)揮著極為要的作用[13, 14]。

.6.6 p30 蛋白的結(jié)構(gòu)特征p30 蛋白是由 HTLV-1 病毒基因組 PX 區(qū)編碼的由 241 個(gè)氨基酸構(gòu)成的，量為 30 kDa 的，與 HTLV-1 病毒的潛伏關(guān)系密切的調(diào)控蛋白[49]。1992 年有兩個(gè)獨(dú)立的研究團(tuán)隊(duì)相繼在 HTLV-1 感染性細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)能夠編個(gè)分子量為 30 kDa 的成熟的 HTLV-1 mRNA[50]。其中，Koralnik 團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)nv/Tax 相同的起始密碼子 AUG 能夠編碼一條分子量為 30 kDa 的蛋白；與此，D’Agostino 發(fā)現(xiàn)一條不依賴于 Env/Tax 起始密碼子 AUG 而獨(dú)立起始編碼量為 30kDa 的病毒蛋白，且位于其碳端的 87 個(gè)氨基酸即為另一個(gè)病毒調(diào)控 p13。隨后，研究人員有相繼在 HTLV-1 陽(yáng)性細(xì)胞、ATL 和 HAM/TSP 病品中分別在基因及蛋白水平上相繼檢測(cè)到編碼 p30 mRNA 及 p30 蛋白。如圖 1.2 所示，p30 蛋白按其功能可以分為 3 個(gè)區(qū)域：核定位區(qū)（NLS）ex 蛋白結(jié)合區(qū)及 PDZ 結(jié)合區(qū)[51]。Ghorbel 團(tuán)隊(duì)通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)到 p30 聚集在細(xì)胞核，這說(shuō)明 p30 極可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子直接參與調(diào)控宿主細(xì)胞通路。另外，p30 蛋白等電點(diǎn)為 11.71，而大量的正電荷有效的促進(jìn)了 p30 酸的結(jié)合能力。

(4) 蓋上蓋子，根據(jù)目的蛋白分子量的大小設(shè)置轉(zhuǎn)膜的時(shí)間及電壓的大小.5.6 免疫印跡分析(1) PVDF封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜立即用PBST清洗三次，每次在搖搖動(dòng)三次，后加入5%的脫脂奶粉放于搖床上封閉3 h；(2) 一抗的孵育：封閉結(jié)束后，PBST清洗三次每次10 min；按Marker和目白的大小，裁剪PVDF膜，加入相應(yīng)的抗體，室溫孵育2 h；(3) 洗膜：孵育結(jié)束后PBST清洗三次每次10 min；(4) 二抗的孵育：清洗后，加上相應(yīng)的二抗，室溫孵育1.5 h；(5) 洗膜：孵育結(jié)束后PBST清洗三次每次10 min；(6) 檢測(cè)：將含有目的條帶的PVDF膜敷上發(fā)光液，曝光顯影。4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1 RBPJ 在 HTLV-1 陽(yáng)性細(xì)胞株中高表達(dá)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 岳希全,石宏,楊力芳;中國(guó)東北地區(qū)HTLV-1的前病毒DNA測(cè)定及其意義[J];中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué);2005年04期

2 林毅勝,吳福林,張志珊;泉州市無(wú)償獻(xiàn)血者4例HTLV-1毒株膜基因系統(tǒng)樹(shù)分析[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2004年05期

3 范文安;合肥地區(qū)正常人群HTLV(1+2)感染狀況[J];臨床輸血與檢驗(yàn);2002年03期

4 王穎彬,張軍,張國(guó)忠,逄淑強(qiáng),徐穎瀟,楊豐,夏寧邵;福建沿海地區(qū)人T淋巴細(xì)胞白血病病毒1型膜基因的克隆和系統(tǒng)樹(shù)分析[J];病毒學(xué)報(bào);2000年03期

5 沈曉梅,楊曉紅,王云娟,賴洵,楊同華,李正發(fā),史克倩;云南HTLV-1成人T細(xì)胞白血病1例[J];白血病;1999年02期

6 楊棉華,余秀葵,莊堅(jiān),鄭璇,莊春蘭,許立德,黃立群;廣東、海南二省HTLV-1感染的流行病學(xué)及其與疾病相關(guān)性的研究[J];汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1997年S1期

7 孫荷,陳國(guó)敏,杜文慧,歐陽(yáng)小梅,龐月嬋,何有明,張君芬,張永利,曾毅;新疆南疆地區(qū)嗜人T淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ型血清流行病學(xué)調(diào)查[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;1997年04期

8 吳偉,錢(qián)成,葛憲民,李平川;合浦縣HIV及HTLV-1的血清流行病學(xué)調(diào)查[J];廣西預(yù)防醫(yī)學(xué);1997年04期

9 楊棉華,陳國(guó)敏,余秀葵,莊春蘭,鄭璇,莊堅(jiān),陳慎奔,廖傳紅,張永利,曾毅;廣東省人群中人嗜T細(xì)胞病毒Ⅰ型感染的血清流行病學(xué)調(diào)查及其與人類(lèi)疾病的關(guān)系[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;1997年01期

本文編號(hào)：2772880