【摘要】：研究背景胃癌的發(fā)病率和致死率一直居高不下,嚴重影響著人們的健康。在所有惡性腫瘤當中,胃癌是第四位常見的惡性腫瘤,并且在世界范圍內(nèi),由于胃癌引起的死亡率在所有癌癥致死率中排名第二,僅次于肺部惡性腫瘤。胃癌是起源于胃粘膜上皮的一種惡性腫瘤,絕大部分胃癌是腺癌,起病隱匿,早期無明顯癥狀,很大一部分病人就診和確診時候已經(jīng)屬于癌癥中晚期階段,預(yù)后往往較差。在胃癌診斷和治療方面,胃癌的早期診斷率低,診治效果不佳,診斷準確性有待進一步的提高,而且胃癌對化療效果較差,對化療藥物容易耐受,治療不當容易復發(fā)和轉(zhuǎn)移播散,患者總體預(yù)后不容樂觀。因此,迫切需要能夠早期準確診斷胃癌的生物標志物和能夠應(yīng)用于胃癌臨床治療的新治療靶點。MicroRNA又簡稱miRNA,是屬于非編碼RNA中的一種小分子RNA,長度約為22個核苷酸,在動物植物中參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,miRNA能與靶基因的特異性目的位點結(jié)合,導致靶基因mRNA的降解或抑制靶基因的翻譯。miRNA在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)基因的表達,在調(diào)控細胞周期、細胞凋亡、細胞分化、組織炎癥反應(yīng)和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要角色。而腫瘤的發(fā)生發(fā)展常常伴隨著某些特異性的miRNA的異常表達,不同腫瘤組織中的miRNA的種類也不盡相同,即使是同一種腫瘤,在疾病發(fā)生發(fā)展的不同時期,miRNA的種類和表達量也不盡相同。所以根據(jù)miRNA的組織特異性和時間特異性,miRNA有望作為多種惡性腫瘤的早期診斷以及疾病檢測的分子標志物,而且miRNA具有調(diào)節(jié)基因表達、調(diào)節(jié)細胞多項生理功能的作用,多項研究也指出miRNA可以作為重要的靶向治療手段輔助治療惡性腫瘤。多項研究報道指出,miR-135b-5p在多種惡性腫瘤(如非小細胞肺癌和乳腺癌)中發(fā)揮著促癌作用,miR-135b-5p可以通過抑制TGFBR2和LAST2的表達從而參與調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞的細胞凋亡和化療藥物的耐受,并且miR-135b-5p可以抑制EVI5和RECK的表達從而調(diào)節(jié)肝癌細胞轉(zhuǎn)移。但是miR-135b-5p在胃癌中的具體表達水平和作用機制尚未有研究報道。MiRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測能夠快捷、有效地幫助研究人員探索miRNA的潛在靶向基因,我們發(fā)現(xiàn)CMTM3有可能是miR-135b-5p的靶向作用基因,共同參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的功能。CMTM家族又稱趨化素樣因子家族(CKLFS),多項研究指出,CMTM3作為一種抑癌基因,在多種惡性腫瘤(比如前列腺癌和腎透明細胞癌)中起著抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要功能,在最近的研究當中發(fā)現(xiàn)CMTM3也與胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān),但是CMTM3在胃癌中的具體調(diào)節(jié)機制仍然未闡述清楚。本研究旨在探究miR-135b-5p如何通過CMTM3調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其潛在機制。綜上所述,探索miR-135b-5p在胃癌組織和胃癌細胞中的表達水平和潛在功能,通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到miR-135b-5p的靶向作用基因,并且進一步地探索靶基因在胃癌中的表達水平和相關(guān)功能以及與miR-135b-5p的表達相關(guān)性,為miR-135b-5p將來作為胃癌的早期診斷,病情監(jiān)測和胃癌靶向精準治療的分子標記物打下重要的理論基礎(chǔ)。研究目的1.檢測胃癌組織,癌旁組織和胃癌細胞系之間的miR-135b-5p的表達水平。2.探索miR-135b-5p在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的具體作用。3.預(yù)測并鑒定miR-135b-5p特異性潛在靶基因,并檢驗是否與miR-135b-5p功能相關(guān)聯(lián)。4.檢測靶基因在胃癌組織,癌旁組織和胃癌細胞系之間的表達水平。5.探索靶基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的功能。6.探索miR-135b-5p對動物模型裸鼠體內(nèi)胃癌移植腫瘤的影響。研究方法1.使用熒光實時定量PCR檢測20對經(jīng)病理診斷確診為胃癌的患者的癌組織樣本和癌周組織樣本中miR-135b-5p的表達水平,在4種胃癌細胞系(HGC-27,SGC-7901,BGC823和MKN45)和一種人源性的正常胃上皮細胞系(GES-1)使用熒光實時定量PCR檢測miR-135b-5p的表達水平。2.首先選擇合適細胞株構(gòu)建了 miR-135b-5p敲低的胃癌細胞株,使用CCK8實驗來檢測敲低miR-135b-5p對胃癌細胞的細胞活力的影響,使用流式細胞術(shù)檢測敲低miR-135b-5p后各個細胞周期所占比例的變化,緊接著使用流式細胞術(shù)檢測敲低miR-135b-5p后的細胞凋亡情況的變化,而Transwell實驗則用于檢測敲低miR-135b-5p后胃癌細胞侵襲能力的變化。3.利用三個經(jīng)典的mi RNA數(shù)據(jù)庫(TargetScan,miRDB和miRanda)進行miR-135b-5p的靶向目標基因預(yù)測,預(yù)測得到miR-135b-5p的潛在靶向基因CMTM3后,使用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測胃癌組織和癌旁胃組織中CMTM3和miR-135b-5p 的表達相關(guān)性,設(shè)計并構(gòu)建 CMTM3-3'-UTR WT 和 CMTM3-3'-UTR Mut質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)入胃癌細胞中,運用熒光酶素實驗驗證CMTM3-3'-UTR是否是miR-135b-5p的靶向作用位點。最后使用蛋白印跡技術(shù)檢測敲低miR-135b-5p之后,CMTM3的蛋白表達水平變化。4.使用熒光實時定量PCR檢測miR-135b-5p的靶向基因CMTM3在胃癌病人的癌組織樣本和癌旁組織樣本中的表達水平,以及在4種胃癌細胞系(HGC-27,SGC-7901,BGC823和MKN45)和一種人源性的正常胃上皮細胞系(GES-1)的表達水平。5.選擇合適細胞株構(gòu)建CMTM3過表達的胃癌細胞株,使用CCK8實驗來檢測CMTM3過表達對胃癌細胞的細胞活力的影響,使用流式細胞術(shù)檢測CMTM3過表達后細胞周期情況和細胞凋亡情況,Transwell實驗則用于檢測CMTM3過表達后腫瘤細胞侵襲能力的變化。6.使用穩(wěn)定敲低miR-135b-5p的胃癌細胞株和對照組胃癌細胞株及未處理組胃癌細胞株分別構(gòu)建裸鼠皮下瘤模型,持續(xù)檢測裸鼠皮下胃癌腫瘤的體積變化和小鼠體重變化。最后處死小鼠之后,收取皮下胃癌腫瘤組織,使用實時熒光定量PCR檢測移植瘤組織中miR-135b-5p的表達水平,免疫組織化學法檢測移植瘤組織中CMTM3的蛋白表達水平。研究結(jié)果1.檢測miR-135b-5p在胃癌和癌旁組織及胃癌細胞系中的表達水平胃癌患者癌組織中的miR-135b-5p的表達水平明顯高于癌周正常對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.01)。miR-135b-5p在胃癌細胞系中的表達水平顯著高于正常的胃上皮細胞系,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.001),而且miR-135b-5p在侵襲性高的SGC-7901胃癌細胞系中的表達水平最高。2.檢測敲低miR-135b-5p后胃癌細胞的細胞增殖能力和侵襲能力的變化CCK8實驗中,敲低miR-135b-5p組的胃癌細胞活力相對于未處理組或者對照組則是明顯降低,差異具有統(tǒng)計學差異(p0.01),流式細胞術(shù)實驗顯示,相對于未處理組和對照組,敲低miR-135b-5p增高G1期細胞所占比例,抑制G1/S期轉(zhuǎn)換;敲低miR-135b-5p增加了早期凋亡和晚期凋亡的細胞,促進細胞凋亡;而且在transwell實驗中,敲低miR-135b-5p能夠減弱胃癌細胞的侵襲能力。3.miR-135b-5p的靶向基因CMTM3的預(yù)測和鑒定三個miRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果得出CMTM3是miR-135b-5p的靶向基因,熒光酶素實驗結(jié)果證實CMTM3-3'-UTR區(qū)是miR-135b-5p的靶向作用位點。PCR實驗顯示,miR-135b-5p的表達水平和CMTM3的表達水平呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系,我們運用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測到敲低miR-135b-5p之后CMTM3的蛋白表達水平明顯上升。4.檢測CMTM3在胃癌癌組織和癌旁組織及胃癌細胞系中的表達情況熒光實時定量PCR檢測結(jié)果顯示,癌組織中的CMTM3的表達水平明顯低于癌周正常對照組(p0.001)。并且CMTM3在胃癌細胞系中的表達水平顯著低于正常的胃上皮細胞系(p0.001),而且CMTM3在侵襲性強的SGC-7901細胞系中的表達水平最低。5.檢測CMTM3過表達對胃癌細胞的細胞增殖能力和侵襲能力的變化CCK8實驗、流式細胞術(shù)和transwell侵襲實驗等功能實驗結(jié)果表明:過表達CMTM3組的胃癌細胞活力相對于未處理組或者對照組則是明顯降低,且差異具有統(tǒng)計學差異(p0.01),相對于未處理組和對照組,過表達CMTM3增高了 G1期細胞所占比例,抑制G1/S期轉(zhuǎn)換;過表達CMTM3使凋亡細胞數(shù)目明顯增加,過表達CMTM3促進細胞凋亡;過表達CMTM3減弱胃癌細胞的侵襲能力。6.構(gòu)建裸鼠成瘤模型檢測miR-135b-5p對體內(nèi)胃癌細胞成瘤能力的影響裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果表明,敲低miR-135b-5p實驗組的轉(zhuǎn)移瘤體積和體重較對照組和未處理組小。而對收獲的轉(zhuǎn)移瘤組織的實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示,敲低miR-135b-5p實驗組的轉(zhuǎn)移瘤組織中的miR-135b-5p水平較對照組低(p0.01),并且轉(zhuǎn)移瘤組織的免疫組織化學檢測結(jié)果表明敲低miR-135b-5p實驗組的CMTM3表達水平明顯較對照組升高。結(jié)論MiR-135b-5p在胃癌的癌組織中呈現(xiàn)明顯的高表達水平,并且敲低miR-135b-5p能夠明顯減低胃癌細胞的細胞增殖能力和細胞侵襲能力。而CMTM3作為mi R-135b-5p調(diào)節(jié)的下游基因,CMTM3在胃癌組織中呈現(xiàn)明顯的低表達水平,其也能通過調(diào)節(jié)胃癌細胞的細胞周期轉(zhuǎn)換和細胞凋亡來影響胃癌細胞的細胞增殖能力。miR-135b-5p能調(diào)節(jié)CMTM3的表達水平,并且能減低胃癌細胞的體內(nèi)成瘤能力。因此miR-135b-5p有希望成為輔助胃癌臨床診斷、疾病監(jiān)測和胃癌靶向治療的新型生物標志物。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

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