【摘要】：研究背景和目的:食管癌是全球范圍內(nèi)較為常見的消化道惡性腫瘤,居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第8位,死亡率的第6位,嚴重危害人類健康。食管癌主要有兩種組織學(xué)類型,食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC),兩者的發(fā)病和地區(qū)分布有顯著的地區(qū)差別,我國以食管鱗癌為主,占所有食管癌的90%以上。盡管近些年來針對惡性腫瘤的靶向治療、免疫治療等取得長足進步,但除手術(shù)和放化療外,針對食管癌尚缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)證實的有效分子靶向或免疫治療手段,因此研究食管癌發(fā)生或發(fā)展的分子機制,為食管癌治療藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ),就變得極其重要。白細胞介素-33(Interleukin-33,IL-33)是新近發(fā)現(xiàn)的具有多種功效的細胞因子,因其基因序列與白細胞介素-1β(IL-1 β)和白細胞介素-18的序列相似,故被歸為IL-1家族成員。IL-33可作為分泌性細胞因子與孤兒受體ST2結(jié)合發(fā)揮作用,也可以定位于細胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用�，F(xiàn)階段有關(guān)IL-33在腫瘤,尤其是食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未完全闡明。腫瘤微環(huán)境中,趨化因子是一類小分子量的、參與炎癥細胞或免疫細胞定向遷移的免疫調(diào)節(jié)因子,在腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CCL2又稱MCP-1(monocyte chemotactic protein 1),其主要作用是誘導(dǎo)血液中的單核細胞定向遷移,但其受體CCR2已在多種組織細胞(例如T細胞、B細胞、NK細胞、中性粒細胞等)和腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn),因而CCL2可直接促進表達CCR2蛋白的腫瘤增殖侵襲,也可招募周圍組織細胞參與腫瘤微環(huán)境的形成而間接發(fā)揮作用。Treg細胞是一群能夠調(diào)控機體免疫功能的細胞亞群,其對機體免疫系統(tǒng)有著非常重要的影響,在腫瘤微環(huán)境中,免疫抑制和免疫激活之間的存在著不平衡,Treg細胞在腫瘤微環(huán)境中對抗腫瘤的免疫反應(yīng)起到抑制作用,促進腫瘤細胞的免疫逃逸,已有一些研究顯示CCL2在腫瘤微環(huán)境中與Treg細胞的招募密切相.關(guān)。我們的研究主要分為三部分。我們首先在臨床組織標本中驗證了 IL-33與食管鱗癌患者的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,接著在細胞實驗中研究IL-33基因?qū)κ彻荀[癌細胞的增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)作用,在動物實驗中探究了 IL-33基因?qū)κ彻荀[癌細胞增殖能力的影響,最后深入探討了 IL-33作為一種分泌性細胞因子與腫瘤微環(huán)境中的趨化因子CCL2和免疫抑制性細胞Treg細胞之間的關(guān)系,揭示了 IL-33影響食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的機制。第一部分 IL-33在食管鱗癌患者中的表達及其臨床意義的分析方法:1)用Real time PCR檢測IL-33在食管鱗癌組織及癌旁組織中的mRNA表達水平并分析其與食管鱗癌患者臨床參數(shù)的相關(guān)性。2)用免疫組化的方法檢測食管鱗癌組織中IL-33的蛋白表達水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。3)用Real time PCR及免疫組化方法檢測IL-33的表達水平與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:1)食管鱗癌組織中IL-33的mRNA的表達水平顯著高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。且食管鱗癌的分期越高,分化程度越差,其腫瘤組織中IL-33 mRNA水平越高。2)IL-33的蛋白表達水平在食管鱗癌組織中顯著高于癌旁組織,且IL-33蛋白表達水平與患者的腫瘤分化程度、腫瘤分期、腫瘤的侵襲程度以及患者的生存顯著相關(guān),而與患者的年齡性別及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性。3)IL-33 mRNA或蛋白高表達的患者組總生存率較低,而IL-33低表達和不表達的食管鱗癌患者的生存率相對較高,結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。小結(jié)1)IL-33在食管鱗癌患者腫瘤組織中的表達顯著高于癌旁組織,IL-33的mRNA及蛋白表達水平與患者的臨床分期和臨床參數(shù)相關(guān),提示IL-33在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。2)IL-33的表達與食管鱗癌患者的腫瘤分化、分期、侵襲程度相關(guān),與食管鱗癌患者生存期顯著相關(guān),即IL-33高表達與患者的總生存時間呈負相關(guān),由此推斷IL-33可以作為判斷食管鱗癌患者預(yù)后的指標。第二部分IL-33對食管鱗癌細胞生物學(xué)行為的影響方法:1)利用Real time PCR的方法檢測IL-33 mRNA在多株食管鱗癌細胞中的表達差異。2)利用CCK-8實驗以及克隆形成實驗觀察過表達IL-33的食管鱗癌細胞增殖能力的變化。3)利用劃痕實驗和Transwell實驗檢測過表達IL-33對食管鱗癌細胞遷移能力的影響。4)利用CCK-8實驗以及克隆形成實驗觀察敲低IL-33的食管鱗癌細胞增殖能力的變化。5)利用劃痕實驗和Transwell實驗檢測敲低IL-33對食管鱗癌細胞遷移能力的影響。6)動物實驗檢測IL-33過表達對裸鼠的食管鱗癌皮下移植瘤的影響。7)動物實驗檢測IL-33敲低對裸鼠的食管鱗癌皮下移植瘤的影響。結(jié)果:1)IL-33mRNA在EC109細胞中表達相對最高,在KYSE450細胞中表達相對最低,因而在過表達IL-33的細胞實驗中選擇KYSE450細胞做病毒轉(zhuǎn)染,在敲低IL-33的細胞實驗中選擇EC109細胞做病毒轉(zhuǎn)染。2)過表達IL-33對食管鱗癌細胞的增殖能力無明顯影響。3)過表達IL-33促進了食管鱗癌細胞的侵襲遷移能力。4)敲低IL-33對食管鱗癌細胞的增殖能力無明顯影響。5)敲低IL-33抑制了食管鱗癌細胞的侵襲遷移能力。6)過表達IL-33促進裸鼠的食管鱗癌移植瘤的生長。7)敲低IL-33抑制了裸鼠的食管鱗癌移植瘤的生長。小結(jié)1)在食管鱗癌細胞中過表達或敲低IL-33對細胞的增殖能力沒有影響,而對食管鱗癌細胞的侵襲和遷移能力有顯著影響。2)在食管鱗癌細胞中過表達或敲低IL-33可影響裸鼠皮下成瘤的體積大小,提示IL-33在體內(nèi)可影響食管鱗癌的增殖。3)細胞實驗和動物實驗結(jié)果的不同可能與IL-33在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要生物學(xué)作用有關(guān)。第三部分IL-33影響食管鱗癌細胞增殖和侵襲遷移的機制研究方法:1)用Cytometric Bead Array及ELISA的方法進行檢驗過表達IL-33或敲低IL-33后細胞上清中細胞因子的變化。2)用Realtime PCR檢測IL-33與CCL2在裸鼠皮下腫瘤組織中的表達量,在ST2基因敲低的細胞和未敲低ST2的食管鱗癌細胞中加入外源性的IL-33,使用Real timePCR和ELISA檢測CCL2的表達量。從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)驗證IL-33與CCL2的關(guān)系。3)用Westernblot的方法探究在食管鱗癌細胞中IL-33調(diào)控CCL2表達的信號通路。4)用流式細胞術(shù)以及transwell系統(tǒng)探究CCL2對食管鱗癌細胞腫瘤微環(huán)境中Treg細胞的趨化作用。5)用Realtime PCR檢測小鼠皮下成瘤組織中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的分子N-CAD、ZEB2、VIM、slug的表達量,初步探討IL-33促進食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制。結(jié)果:1)在過表達和敲低IL-33的食管鱗癌細胞上清中表達量與對照組相比差異最大的就是CCL2,提示CCL2可能參與IL-33發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的過程。2)在過表達IL-33的腫瘤組織中,CCL2的表達量也顯著增高;在敲低IL-33的腫瘤組織中,CCL2的表達量也顯著下降。在未敲低ST2基因的食管鱗癌細胞中,加入外源性的IL-33可使得CCL2的mRNA及蛋白表達明顯升高,差異與加入IL-33之前相比有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。而敲低IL-33的受體ST2以后再加入外源性的IL-33,食管鱗癌細胞中CCL2的mRNA和蛋白的表達相比于加入IL-33之前只輕微升高,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果也顯示,IL-33與CCL2的表達呈顯著正相關(guān)。3)抑制NF-κB通路后CCL2的表達量也顯著下降,加入外源性IL-33后NF-κB通路顯著被激活,而在食管鱗癌細胞中敲低IL-33的受體ST2后,NF-κB通路的激活被抑制,CCL2的表達量也隨之下降。4)CCL2對Treg細胞有趨化作用,CCL2可招募Treg細胞在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制作用,進而促進食管鱗癌細胞的免疫逃逸和增殖。5)N-CAD、ZEB2、VIM、slug的mRNA表達水平在shIL-33組裸鼠腫瘤組織中明顯低于NC組皮下腫瘤,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。小結(jié)1)IL-33可通過結(jié)合其受體ST2,并通過NF-κB信號通路促進CCL2的表達。2)CCL2可招募免疫抑制性的Treg細胞進入食管鱗癌微環(huán)境中,進而促進腫瘤細胞的免疫逃逸。IL-33促進食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的機制可能是通過促進CCL2的表達來招募Treg細胞而發(fā)揮作用的。3)IL-33促進食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制可能與促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān),其中的具體機制尚待進一步深入探討。結(jié)論1)IL-33在食管鱗癌患者腫瘤組織中的表達顯著高于癌旁組織,IL-33的表達水平與患者的臨床分期和臨床參數(shù)相關(guān),IL-33可以作為判斷食管鱗癌患者預(yù)后的指標。2)IL-33基因?qū)κ彻荀[癌細胞的增殖能力沒有影響,而對食管鱗癌細胞的侵襲和遷移能力有顯著影響,其機制可能與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。3)IL-33可通過NF-κB信號通路促進CCL2的分泌,進而招募Treg細胞,促進腫瘤的免疫逃逸,進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1
【圖文】：

并用Ｒｅａｌｔｉｍｅ邋ＰＣＲ檢測ｆ邋ＩＬ－３３邋ｍＲＮＡ的表達水平，結(jié)果顯示食管逡逑鱗癌組織中丨Ｌ－３３的ｍＲＮＡ的表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義逡逑（ｐ＝０．０００６）（如圖１．１Ａ）。８７例食管鱗癌患者的臨床分期為Ｔ１期６例，Ｔ２期為逡逑３８例，Ｔ３期為４３例，如（圖１．１Ｂ）；且食管鱗癌的分期越高，分化程度越差，逡逑其腫瘤組織中丨Ｌ－３３ｍＲＮＡ平越高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義如（圖ｉ．１Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｃ逡逑§４０－．邐Ｐ＝０．０００６逡逑１邋３０－邐＇邐－４邐ｔ邋＇邐＇邐邐邐Ｈ逡逑Ｉ－邐Ａ邐—ｆ邋ｉ邋！邋�。卞澹矗蓿掊义希�°Ｊ邐＾邐§１邐１邐＾｜；邋ｐｉ，邋丁逡逑丨丨ｉ邐■邐．邋ｗｉ邋ｔ逡逑Ａｄｊａｃｅｎｔ邐Ｔｕｍｏｒ邐Ｐｏｏｒ邐Ｗｅｌｌ逡逑圖１．１食管鱗癌組織及癌旁組織中的ＩＬ－３３的表達逡逑Ａ．８７例食管淲癌組織中ＩＬ－３３的ｍＲＮＡ的表達水平顯著高于癌旁組織，逡逑（Ｐ＝０．０００６）；逡逑Ｂ邋．丨Ｌ－３３的ｍＲＮＡ表達水平在不同分期食管鱗癌組織中的表達（＊ｐ＜0．0５）：逡逑Ｃ．ＩＬ－３３的ｍＲＮＡ表達水平在不同分化程度的食管鱗癌組織中的表達（＊丨ｙｏ邋ｏｓ）。逡逑３．２食管鱗癌及癌旁組織中ＩＬ－３３蛋白的表達水平逡逑為進一步了解１Ｌ－３３的蛋白表達水平，我們通過免疫組化的方法檢測了食管逡逑鱗癌患者鱗癌組織和癌旁組織中ＩＬ－３３蛋白的表達（如圖１．２Ａ）。從染色結(jié)果可逡逑以看出丨Ｌ－３３蛋白－般在細胞質(zhì)和細胞膜表面表達，８７例患者的食管鱗癌組織逡逑中，ＩＬ－３３蛋白的陽性表達率為７４．７１％（６５／８７），即ＩＬ－３３高表達的食管鱗癌患者逡逑經(jīng)統(tǒng)計為６５例

ＴＥ７細胞中ＲＮＡ進行提取并對ＩＬ－３３ｍＲＮＡ表達水平進行檢測比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)逡逑ＩＬ－３３邋ｍＲＮＡ在ＥＣ１０９細胞中表達相對最高，在ＫＹＳＥ４５０細胞中表達相對最逡逑低（如圖２．１Ａ），邋ＰＣ０．０５，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，后又對這些ＰＣＲ結(jié)果展開蛋白逡逑水平的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ驗證（如圖２．１Ｂ）。通過這部分研究，我們就選擇了邋ＫＹＳＥ４５０逡逑細胞作為過表達ＩＬ－３３的目的細胞，選擇ＥＣ１０９細胞作為穩(wěn)定敲低ＩＬ－３３的目的逡逑細胞。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑Ｚ逡逑Ｅ｜0邋｜逡逑？ｇ＊５邋Ｉ邋［ＩＩ邋１１邐４今、、？逡逑■５邋0邋幨圈邐U澹櫻潁危保幣唬潁睿恚礤義希歟椋幔悖簦酰殄澹埃埃掊危恚簦恚礤危恚恚礤義希桑蹋常沖義希牽粒校模儒義賢跡玻卞澹桑猓常沖澹恚遙危獵謔徹軠W癌細胞中的表達逡逑Ａ．邐Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ的方法檢測實驗室永生化食管淲癌細胞Ｈｅｔ－１邋ａ及其它食管鱗癌細胞逡逑中丨Ｌ－３３ｍＲＮＡ表達水平并用ＰＣＲ驗證（ＰＣ０．０５）；逡逑Ｂ．邐Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ驗證以上細胞中丨Ｌ－３３的表達水平。逡逑３．２過表達ＩＬ－３３的食管淲癌細胞增殖能力的變化。逡逑因為ＫＹＳＥ４５０細胞的ＩＬ－３３的表達量相對最低，所以選擇在該細胞中轉(zhuǎn)染逡逑ＩＬ３３過表達載體。轉(zhuǎn)染ＫＹＳＥ４５０細胞后流式分選并獲得陽性細胞，接著我們通逡逑過Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ方法檢測ＩＬ－３３的過表達效果（如圖２．２Ａ）。結(jié)果顯示，與空逡逑載體對照組（ＯＥ－ＮＣ）相比，轉(zhuǎn)染過表達ＩＬ－３３慢病毒的ＯＥ－ＩＬ－３３細胞ＩＬ－３３逡逑ｍＲＮＡ的表達水平明顯升高

邐ＮＣ邐ＯＥＬ－３３逡逑圖２．３過表達１Ｌ－３３促進了食管淲癌細胞的侵襲遷移能力逡逑Ａ．ＯＥ－ＮＣ細胞中，細胞的侵襲能力明顯低于對照的ＯＥ－１Ｌ－３３組（＊＊＊Ｐ＜０．００１）；逡逑Ｂ邋．過表達１Ｌ－３３促進了食管＾癌細胞的遷移能力。逡逑３．４穩(wěn)定敲低ＩＬ－３３的食管淲癌細胞的構(gòu)建逡逑在３．１部分的研究中，我們發(fā)現(xiàn)ＥＣ１０９細胞相對于實驗室其它細胞表達ＩＬ－３３逡逑最高，于是在此部分的研宄中我們選擇ＥＣ１０９作為敲低ＩＬ－３３的細胞，并建立逡逑了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞ｓｈＩＬ－３３，為后續(xù)實驗做準備。結(jié)果如圖２．４所示，流式細胞術(shù)逡逑檢測轉(zhuǎn)染陽性的細胞，結(jié)果提示慢病毒轉(zhuǎn)染效率為９５．１％邋（圖２．４Ａ），進一步逡逑地，我們通過Ｒｅａｌ邋Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ和ｗｅｓｔｅｒｎ檢測驗證了邋ＩＬ－３３的穩(wěn)定敲低（圖２．４Ｂ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑Ｅ邐｜｜？ｉ邐邋Ｉ邋１１邐令0邋／逡逑９５．１％邐《９３．５％邐＾邐１邐一一逡逑＾邋＼邐Ｉ邐—｜￣邐ｍｍｍ邋ｍｍｍ邋ａｃｔｉｎ逡逑Ｊ｜．邋－ｖ邐

【參考文獻】

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本文編號：2771390