【摘要】：【背景】肝細(xì)胞肝癌是世界上第六大常見的腫瘤,其致死率高居所有腫瘤的第三位。盡管肝癌的診療技術(shù)在不斷的提高,但因肝癌發(fā)病因素復(fù)雜、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、對(duì)化療不敏感和手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)等原因,肝癌患者的整體生存率仍然不高。因此,深入肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制研究,尋找新型的潛在的肝癌治療靶點(diǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。著絲粒是染色單體上的蛋白結(jié)構(gòu)體,在染色體分離的過程中起到重要的調(diào)控作用,其調(diào)節(jié)失調(diào)或功能紊亂會(huì)導(dǎo)致非整倍體的出現(xiàn)和促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。著絲粒至少由80種不同的著絲粒蛋白組成,包括著絲粒蛋白A、B、C、I、K和M等,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。著絲粒蛋白K(Centromere protein K,CENPK)是著絲粒蛋白家族成員之一,在維持著絲粒的功能和有絲分裂過程中可以起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),CENPK在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào),并與腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān),可能扮演著致癌基因的角色。然而,CENPK在肝癌中表達(dá)情況及臨床意義尚不明確,其具有的生物學(xué)功能和相關(guān)機(jī)制也有待進(jìn)一步深入探索。因此,本研究的主要目的是探討CENPK在肝癌中的表達(dá)及其相關(guān)的功能和機(jī)制。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.探討CENPK在肝癌中的表達(dá)情況及臨床意義;2.研究CENPK對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)功能的影響;3.探討CENPK調(diào)控肝癌細(xì)胞惡性改變的相關(guān)機(jī)制。【實(shí)驗(yàn)方法】1.首先在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)分析CENPK在肝癌中的表達(dá)情況及臨床意義,然后在臨床收集的肝癌標(biāo)本上利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)CENPK的表達(dá),對(duì)TCGA的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證;2.構(gòu)建CENPK干擾病毒載體,感染肝癌細(xì)胞系,建立穩(wěn)定下調(diào)CENPK表達(dá)和對(duì)照組NC的肝癌細(xì)胞。通過Celigo細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8、平板克隆形成、劃痕以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CENPK對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響;通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),在體內(nèi)檢測(cè)CENPK對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響;3.利用基因芯片技術(shù)篩選穩(wěn)定下調(diào)CENPK表達(dá)組和對(duì)照組NC肝癌細(xì)胞BEL-7404之間差異的基因表達(dá)譜,通過IPA分析獲得CENPK調(diào)控的關(guān)鍵通路分子,然后通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western Blot和細(xì)胞免疫熒光方法進(jìn)行驗(yàn)證;利用YAP1干擾病毒下調(diào)肝癌細(xì)胞中YAP1的表達(dá),觀察下調(diào)YAP1的表達(dá)后肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的改變。在CENPK穩(wěn)定下調(diào)的肝癌細(xì)胞SMMC-7721中過表達(dá)YAP1后觀察肝癌細(xì)胞的功能恢復(fù)情況。進(jìn)一步通過Western Blot方法檢測(cè)CENPK和YAP1對(duì)EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響�！緦�(shí)驗(yàn)結(jié)果】1.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示,CENPK在肝癌組織中表達(dá)升高,與臨床分級(jí)、T分期、病理分期和患者預(yù)后相關(guān);在本科室收集的肝癌組織和相對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本中證實(shí)CENPK的mRNA水平在肝癌組織中表達(dá)增高(86.7%,26/30),蛋白水平也在肝癌組織中表達(dá)增高(75%,6/8)。2.成功構(gòu)建CENPK干擾慢病毒載體并感染肝癌細(xì)胞系BEL-7404和SMMC-7721,構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)CENPK的肝癌細(xì)胞;通過Celigo細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK-8、平板克隆形成和裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)CENPK的表達(dá)后能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力;通過劃痕以及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)CENPK的表達(dá)后能夠抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力;3.基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,CENPK主要與惡性實(shí)體瘤、腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞增殖、干細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞侵襲、細(xì)胞侵襲和上皮組織的發(fā)育等疾病或功能相關(guān),YAP1可能在CENPK參與調(diào)控肝癌惡性進(jìn)展中起到重要的作用;熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western Blot和細(xì)胞免疫熒光方法證實(shí)下調(diào)CENPK的表達(dá)后肝癌細(xì)胞中YAP1的mRNA和蛋白的表達(dá)均降低;4.利用YAP1干擾病毒能夠成功下調(diào)肝癌細(xì)胞中YAP1的表達(dá),下調(diào)YAP1的表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,可以部分模擬下調(diào)CENPK對(duì)肝癌惡性進(jìn)展的抑制作用,而過表達(dá)YAP1的表達(dá)后能夠部分恢復(fù)下調(diào)CENPK所起到的抑制效應(yīng);5.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,下調(diào)CENPK和YAP1的表達(dá)后都能夠上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá),而降低間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin的表達(dá);在穩(wěn)定下調(diào)CENPK表達(dá)的肝癌細(xì)胞SMMC-7721中過表達(dá)YAP1后,可以部分逆轉(zhuǎn)下調(diào)CENPK所引起的EMT的抑制效應(yīng)�！窘Y(jié)論】1.CENPK在肝癌組織表達(dá)增高,與肝癌的惡性表型及預(yù)后相關(guān);2.下調(diào)CENPK的表達(dá)能夠在體內(nèi)外水平抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力;3.下調(diào)CENPK的表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的EMT過程,過表達(dá)YAP1后能部分恢復(fù)抑制EMT的作用;4.CENPK可以通過調(diào)控YAP1的表達(dá)影響肝癌的惡性進(jìn)展。靶向作用于CENPK/YAP1可以為肝癌的治療提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文-16-圖1. 肝癌診斷路線圖理有據(jù)，避免不合適過度醫(yī)療。此外也要注意手術(shù)后的治療，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的時(shí)間，提高患者的生存質(zhì)量。局部消融治療為中晚期不耐受手術(shù)切除的肝癌患者提供了新的治療手段，使其可能獲得根治的機(jī)會(huì)。常見消融手段包括射頻消融（RFA）、微波消融（MWA）和無(wú)水乙醇注射治療（PEI）等。TACE治療目前在臨床上應(yīng)用廣泛，這就要求我們臨床工作者必須嚴(yán)格按照介入療法的基本原則進(jìn)行操作，準(zhǔn)確把握其適應(yīng)癥和禁忌癥，對(duì)術(shù)后發(fā)生的不良反應(yīng)要積極對(duì)癥治療。放療多為姑息性治療，可能會(huì)使肝癌患者獲得手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，也可以延緩肝癌的進(jìn)展，相對(duì)提高患者的生存質(zhì)量。全身治療可以聯(lián)合以上治療手段或單獨(dú)使用來改善肝癌患者腫瘤相關(guān)癥狀，延長(zhǎng)生存時(shí)間。主要包括抗腫瘤治療、抗病毒治療和對(duì)癥治療�？鼓[瘤治療包括分子靶向藥物（索拉非尼）、系統(tǒng)化療（阿霉素、順鉑等）、免疫治療（干擾素α、胸腺法新等）、中醫(yī)藥治療（槐耳顆粒、華蟾素等）等；抗病毒治療在整個(gè)肝癌治療的過程中都應(yīng)該積極使用

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文-17-圖2. 肝癌臨床分期及治療線路圖4. 肝癌治療的新進(jìn)展目前手術(shù)切除、肝移植和射頻消融術(shù)是認(rèn)可的具有明確效果的肝癌治愈性手段[50]。近年來隨著研究的深入，在化學(xué)治療、免疫治療和分子靶向治療等方面也取得了一些新的進(jìn)展。在手術(shù)切除或者肝移植術(shù)后使用小分子靶向藥物進(jìn)行系統(tǒng)性全身化療已被廣泛應(yīng)用，特別適用于經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞失敗的患者[51]。但是，肝癌化療依然存在著劑量限制性、多重耐藥性等弊端[52]。在應(yīng)用于全身治療肝癌的各種多激酶抑制劑中，索拉非尼是唯一被FDA批準(zhǔn)的用于治療晚期肝癌的藥物[53]。研究表明，單用索拉非尼藥物治療的肝癌患者可以延長(zhǎng)總生存期3個(gè)月，延緩了進(jìn)展成為晚期肝癌的時(shí)間[54]。索拉非尼可以通過靶向抑制多種基因（VEGF-1/2/3、PDGFR-β、Raf和RET等）進(jìn)而起到抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤增殖的作用，適用于手術(shù)切除和射頻消融術(shù)后患者的輔助治療。瑞格非尼是索拉非尼的氟衍生物

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文-22-圖3. 腫瘤細(xì)胞YAP/TAZ功能示意圖Zanconato F, et al. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 20162. YAP/TAZ在常見腫瘤中的表達(dá)及特性2.1 肺癌肺癌包括幾種類型，通常將肺腺癌（LAC）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LSCC）、大細(xì)胞肺癌定義為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。免疫組織化學(xué)研究結(jié)果表明，YAP或TAZ在腫瘤組織中表達(dá)升高，并與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后不良息息相關(guān)[105-108]。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，在通過致癌基因KRas的激活和Tp53（或Lkb1）等位基因缺失共同誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性肺腺癌模型中可以發(fā)現(xiàn)高水平的YAP/TAZ定位于細(xì)胞核中[109, 110]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)從基因水平上降低YAP的表達(dá)能夠明顯減少在KrasG12D、Lkb1L/L小鼠模型中所形成的腫瘤的數(shù)量，更有趣的是所形成的病灶大多數(shù)是良性的，而且不會(huì)發(fā)展成為肺腺癌或肺鱗狀細(xì)胞癌；YAP/TAZ的激活自身可能不足以促進(jìn)NSCLC的形成：在小鼠氣道上皮中具有表達(dá)活性的YAP僅能引起組織增生，其本身不足以引發(fā)腫瘤的形成[110]。然而

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本文編號(hào)：2770883