【摘要】：背景與目的胃癌是一種發(fā)病率較高且預(yù)后較差的惡性腫瘤之一,是全球發(fā)病率第五位的惡性腫瘤,致死率僅次于肺癌、肝癌,居第三位,嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。雖然在胃癌的診斷及治療方面,業(yè)已取得較大的進(jìn)步,但針對早期胃癌的診斷及進(jìn)展期胃癌的診療尚顯局限。目前國際上尚沒有一致公認(rèn)的進(jìn)展期胃癌標(biāo)準(zhǔn)化療方案。調(diào)整現(xiàn)有的用藥策略以及尋找更為有效的聯(lián)合治療方案是治療進(jìn)展期胃癌的一個重要的研究方向。MicroRNA(miRNAs)是內(nèi)源性的長度約21-25nt的一類非編碼RNA,具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)活性的功能,廣泛存在于真核生物體中,并在進(jìn)化序列中保守,參與了機(jī)體的生物學(xué)進(jìn)程,包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。近年研究發(fā)現(xiàn),MicroRNA-195-5p(miR-195-5p)屬microRNAs其中的一類別,研究證實,miR-195-5p在乳腺癌,骨肉瘤及結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)異常,并在腫瘤細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)及腫瘤的形成過程中起到一定的作用。但因miRNA分子靶向調(diào)控蛋白編碼基因的多樣性,miR-195-5p如何在胃癌組織中發(fā)揮作用從而改變腫瘤細(xì)胞功能表型的機(jī)制研究尚需進(jìn)一步明確。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)是一種相對分子質(zhì)量為(1.6-1.8)×10~4,能促進(jìn)來源于中胚層及神經(jīng)外胚層細(xì)胞增殖的多肽生長因子,能刺激成纖維細(xì)胞的分裂增殖,并且它的等電點呈堿性(pH 9.6),因而被命名為堿性FGF。除此以外,其還具有廣泛的生物學(xué)活性,比如,其能促進(jìn)血管生成;改善創(chuàng)傷愈合;加速神經(jīng)營養(yǎng)與修復(fù)并且促進(jìn)胚胎發(fā)育與分化特性等,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。有研究表明bFGF在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,但目前針對bFGF對胃癌的影響及機(jī)制發(fā)生的基礎(chǔ)研究相對較少。本研究擬評估胃癌患者腫瘤組織中miR-195-5p與bFGF mRNA的表達(dá)關(guān)系,并進(jìn)一步分析miR-195-5p是否通過直接靶向bFGF來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。方法通過Target Scan Human,ComiR等數(shù)據(jù)庫查詢miR-195-5p的潛在靶標(biāo)。采用MicroRNA分析方法、實時定量熒光PCR和Western blot等檢測方法評估m(xù)iR-195-5p和bFGF mRNA及蛋白的表達(dá)水平。使用miR-195-5p mimics和對照mimics轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SNU-1和KATO-3。用劃痕試驗及transwell侵襲實驗來檢測miR-195-5p mimics和對照組轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞系的遷移及侵襲能力。運用雙熒光素酶報告實驗驗證miR-195-5p與靶基因bFGF的直接聯(lián)系。構(gòu)建含bFGF基因的慢病毒并感染穩(wěn)表達(dá)miR-195-5p的胃癌細(xì)胞,再次評估細(xì)胞的遷移及侵襲能力。構(gòu)建SCID小鼠的胃癌異體移植瘤模型,注射后二十天處死裸鼠,切下瘤體后稱重并測量,隨后固定瘤體組織備進(jìn)一步分析使用。結(jié)果(1)人胃癌組織中miR-195-5p和bFGF mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.735,p0.001);(2)穩(wěn)表達(dá)miR-195-5p的細(xì)胞系SNU-1和KATO-3中,胃癌細(xì)胞bFGF mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低;(3)SNU-1和KATO-3的劃痕實驗和侵襲實驗結(jié)果顯示:劃痕后24 h穩(wěn)表達(dá)miR-195-5p的SNU-1和KATO-3細(xì)胞系遷移距離小于對照組細(xì)胞;與對照組相比,穩(wěn)表達(dá)miR-195-5p的SNU-1和KATO-3細(xì)胞系顯著降低侵入細(xì)胞數(shù)目,結(jié)果提示miR-195-5p抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲;(4)熒光素酶活性測定實驗結(jié)果顯示:穩(wěn)定過表達(dá)胃癌細(xì)胞系中miR-195-5p表達(dá)水平升高;在胃癌細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)上述兩種熒光素酶載體時,miR-195-5p過表達(dá)降低了野生型bFGF 3’-UTR-wt的熒光素酶活性,而突變型bFGF3’-UTR-mut的熒光素酶活性沒有改變,驗證了miR-195-5p直接識別和靶向bFGF3’-UTR,從而抑制bFGF表達(dá);(5)建立穩(wěn)表達(dá)miR-195-5p的胃癌小鼠移植模型,根據(jù)腫瘤重量及大小數(shù)據(jù)檢測,與對照組相比,miR-195-5p組腫瘤的重量與體積明顯被抑制;(6)結(jié)合動物實驗結(jié)果,穩(wěn)表達(dá)miR-195-5p的SNU-1和KATO-3兩種腫瘤模型中,腫瘤組織中bFGF mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均受到抑制,與我們先前的體外實驗數(shù)據(jù)一致。這表明miR-195-5p在體內(nèi)體外均能下調(diào)bFGF的表達(dá)。同時在SNU-1和KATO-3細(xì)胞株中過表達(dá)miR-195-5p和bFGF后,bFGF mRNA和蛋白表達(dá)水平在兩種胃癌細(xì)胞系中恢復(fù)到對照水平。(7)SNU-1和KATO-3細(xì)胞過表達(dá)miR-195-5p后其細(xì)胞遷移和侵襲能力下降,在這兩種細(xì)胞中重新引入bFGF因素后這種抑制作用能夠被逆轉(zhuǎn)。當(dāng)這些細(xì)胞被注射到SCID小鼠體內(nèi)建立異種移植模型時,bFGF的表達(dá)明顯逆轉(zhuǎn)了miR-195-5p對胃癌腫瘤的抑制作用。結(jié)論miR-195-5p通過直接靶向作用bFGF來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程,通過調(diào)節(jié)降低bFGF的表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌的發(fā)生。這為我們研究胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路,為改進(jìn)進(jìn)展期胃癌的治療方案(靶向治療)提供了新的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

3 結(jié)果3.1 人胃癌組織中 miR-195-5p 與 bFGF mRNA 表達(dá)的負(fù)相關(guān)性通過 Target Scan Human，ComiR 等數(shù)據(jù)庫查詢分析[24]，我們發(fā)現(xiàn)了 miR-19序列自 5’端起存在與 bFGF mRNA 3’-UTR 區(qū)上的互補(bǔ)配對的識別序列 (圖 1提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，bFGF 很可能是 miR-195-5p 的一個潛在作用的下標(biāo)，miR-195-5p 有可能直接針對 bFGF mRNA 并介導(dǎo)其降解。我們分析比較了例胃癌患者組織標(biāo)本中 miR-195-5p 與 bFGF mRNA 表達(dá)水平的相關(guān)性。如圖所示，miR-195-5p 與 bFGF mRNA 呈負(fù)相關(guān)(r=-0.735，P < 0.001)。

between miR-195-5p and bFGF mRNA in tumor samples from 18 GC patienValues were in arbitrary units (au). (B) Possible miR-195-5p complementasequence on the 3’-UTR of bFGF mRNA3.2 miR-195-5p 過表達(dá)可明顯下調(diào)SNU-1及 KATO-3 細(xì)胞中bFGF mRNA及蛋表達(dá)水平通過 miR-195-5p mimics 轉(zhuǎn)染 SNU-1 和 KATO-3 細(xì)胞，并以 control mim染這兩株細(xì)胞作為對照，運用實時定量 PCR 及 Western blot 檢測方法，miR-195-5p 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中 bFGF mRNA 及 bFGF 蛋白表達(dá)水平差異，miR-195-5p 過表達(dá)可明顯下調(diào)這兩株細(xì)胞系中 bFGF mRNA 表達(dá)水平及 bFGF表達(dá)水平。（圖 2A 和 2B）

spectively with actin as the loading the control. Values were mean ± SD froast three independent experiments. ** P<0.01, * P<0.05, compared to the contro.3 miR-195-5p 過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲本實驗組分別通過劃痕實驗和 transwell 侵襲實驗來研究 SNU-1 和 KAT系的遷移和侵襲能力。圖3A和3B顯示兩個細(xì)胞系劃痕后24小時創(chuàng)傷愈合表達(dá) miR-195-5p 的細(xì)胞遷移距離小于對照組的細(xì)胞。圖 3C 和 3D 細(xì)胞侵襲果顯示，與對照組相比，SNU-1 和 KATO-3 細(xì)胞系中 miR-195-5p 的過表達(dá)低了侵襲細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明 miR-195-5p 過表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞的遷移和侵。

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本文編號：2770006