【摘要】：研究背景:惡性腫瘤是威脅人類健康最主要疾病之一,其發(fā)病率呈逐年遞增趨勢,其中乳腺癌是為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,全球乳腺癌每年新發(fā)病例為 100多萬,其中死亡例數(shù)為40多萬。乳腺癌也是中國女性最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率也在逐年升高,因此乳腺癌在全球范圍內(nèi)被廣泛研究。雖然乳腺癌是當今研究的熱點之一,但因其發(fā)病機制復雜,現(xiàn)在還沒有特效的方法根治。深入研究其發(fā)病機制為臨床提供新的治療靶點,成為亟待解決的問題。瞬時受體電位(transient receptor potential, TRP)通道絕大多數(shù)是一種陽離子非選擇性通道,由六次跨膜的α螺旋結構域和胞內(nèi)的N末端和C末端組成,并由第五第六跨膜結構域構成孔道區(qū)。TRP通道形成功能性同聚四聚體或異聚四聚體,在信號轉到中發(fā)揮作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)TRP通道家族和胃癌、前列腺癌、白血病及淋巴瘤等多種惡性腫瘤相關。TRPM7(transient receptor potential malestatin7)屬于LTRP亞族,同時具有蛋白激酶結構和陽離子通道結構。有文獻報道TRPM7在肺癌、膀胱癌以及乳腺癌中存在高表達,并與細胞增殖和轉移相關。近年來的研究表明,包括乳腺癌在內(nèi)的腫瘤組織內(nèi)存在一小部分致瘤能力特別強,分化程度極低的細胞,具有干細胞的自我更新及多向分化特性,稱為“腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)”。腫瘤干細胞在啟動腫瘤形成和生長中發(fā)揮著決定性的作用,是導致腫瘤復發(fā)、轉移及化療耐藥的根源。體內(nèi)外實驗都表明,乳腺腫瘤干細胞對放化療都有抗藥性。傳統(tǒng)的腫瘤治療針對的是普通腫瘤細胞,卻無法從根本上消滅腫瘤干細胞,治療后腫瘤干細胞重新形成腫瘤組織并導致腫瘤復發(fā)和轉移。更有效的腫瘤治療需要在清除普通腫瘤細胞的同時也清除腫瘤干細胞。因而新的治療手段和新靶標的發(fā)現(xiàn)迫在眉睫,是近年來惡性腫瘤治療的研究熱點。TRPM7是否在乳腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲過程中發(fā)揮重要功能,是否對乳腺癌干細胞有調(diào)控作用,從而影響乳腺癌對化療藥物的耐受,還未見文獻報道。目的:研究TRPM7對乳腺癌細胞系的增殖、遷移、侵襲等功能的影響,并探討可能的調(diào)控機制。方法:本研究采用 QPCR、Western blot、免疫組化驗證 TRPM7 在乳腺癌組織以及乳腺癌細胞的mRNA 和蛋白表達。施加特異性抑制TRPM7蛋白表達的shRNA和TRPM7非特異性離子通道抑制劑2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-APB)處理細胞,利用MTT、transwell以及劃痕愈合等實驗研究TRPM7對乳腺癌細胞的功能影響。流式細胞術用于檢測細胞周期以及乳腺腫瘤干細胞的變化。Western blot用于檢測相關信號通路的改變。比較兩種抑制劑作用后相關功能及信號通路變化,明確TRPM7雙活性蛋白的具體功能差異。結果: 1、TRPM7在乳腺癌組織中高表達,TRPM7在化療后乳腺癌組織中表達升高,并且TRPM7的高表達與乳腺癌病人較差的預后有相關性。收集乳腺癌組織標本,使用免疫組化檢測乳腺癌組織及其相對應癌旁正常組織中TRPM7的表達,發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中表達高于癌旁正常組織,QPCR結果顯示乳腺癌組織TRPM7的mRNA高于癌旁正常組織;QPCR檢測同一患者化療前后乳腺癌組織中TRPM7 的mRNA表達,顯示化療后乳腺癌組織TRPM7的mRNA表達高于化療前。同時進一步檢索數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),高表達TRPM7的乳腺癌患者總體生存情況差。 2、抑制TRPM7蛋白表達能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲。使用慢病毒轉染體系建立穩(wěn)定抑制TRPM7蛋白表達(特異性抑制TRPM7蛋白表達的shRNA)的乳腺癌MDA-MB-231細胞系和乳腺癌MCF7細胞系。MTT實驗發(fā)現(xiàn),特異性抑制TRPM7蛋白表達的shRNA能抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖能力,但無明顯抑制乳腺癌MCF7細胞的增殖能力;劃痕修復實驗以及transwell小室實驗分別顯示特異性抑制TRPM7蛋白表達的shRNA抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力。 3、特異性抑制TRPM7蛋白表達的shRNA作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞發(fā)生細胞周期阻滯、凋亡增加以及MET過程。流式細胞術檢測細胞周期發(fā)現(xiàn),特異性抑制TRPM7蛋白表達的shRNA作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞后細胞出現(xiàn)了G1期阻滯以及出現(xiàn)凋亡增加,從而影響了增殖能力。 Western blotting結果顯示,vimentin表達降低,E-cadherin表達升高,出現(xiàn)了典型的EMT過程,從而降低了細胞的遷移和侵襲能力。 4、TRPM7在乳腺癌MDA-MB-231細胞干細胞中高表達,特異性抑制TRPM7蛋白表達的shRNA作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞會下調(diào)乳腺癌干細胞比例,從而增強乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性。使用ALDEFLUOR檢測分選乳腺癌MDA-MB-231細胞的干細胞,并對其進行QPCR檢測,發(fā)現(xiàn)TRPM7在ALDH+乳腺癌干細胞亞群中mRNA表達升高;同時結果顯示特異性抑制TRPM7蛋白表達的shRNA能夠降低乳腺癌MDA-MB-231細胞中ALDH+乳腺癌干細胞的比例。施加紫杉醇化療藥物處理,發(fā)現(xiàn)特異性抑制TRPM7蛋白表達的shRNA抑制組乳腺癌MDA-MB-231細胞呈現(xiàn)出較高的化療敏感性,另外相比對照組,抑制組化療后的ALDH+腫瘤干細胞比例明顯下降。 5、特異性抑制TRPM7蛋白表達著影響STAT3和AKT信號通路。使用Western blot 檢測細胞內(nèi)主要信號通路的磷酸化情況,結果顯示特異性抑制TRPM7蛋白表達顯著降低乳腺癌MDA-MB-231細胞 STAT3和AKT的磷酸化水平。推測TRPM7可能通過這兩條信號通路調(diào)節(jié)腫瘤干細胞。 6、抑制TRPM7離子通道活性能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲,周期阻滯、凋亡增加以及下調(diào)乳腺腫瘤干細胞比例,但只影響AKT信號通路。使用TRPM7非特異性離子通道抑制劑2-APB處理乳腺癌MDA-MB-231細胞,重復之前的功能實驗,結果顯示抑制TRPM7離子通道活性能夠抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移和侵襲,周期阻滯、凋亡增加以及下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細胞干細胞比例,趨勢與特異性抑制TRPM7蛋白表達結果一致,但除了增殖抑制,其余程度均不如特異性抑制TRPM7蛋白表達。信號通路方面則僅抑制AKT通路,可能對STAT3無作用。結論:(1)TRPM7在乳腺癌中高表達,與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及預后有顯著相關性;(2)特異性抑制TRPM7蛋白表達能夠通過下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細胞干細胞比例、發(fā)生G1期阻滯、發(fā)生MET過程及降低磷酸化STAT3和磷酸化AKT蛋白水平從而抑制乳腺腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力;(3)特異性抑制TRPM7蛋白表達能夠下調(diào)乳腺癌MDA-MB-231細胞的干細胞比例,并增強乳腺癌MDA-MB-231細胞對紫杉醇的敏感性;(4)TRPM7主要通過STAT3和AKT信號通路發(fā)揮功能;(5)TRPM7離子通道活性參與大部分乳腺癌MDA-MB-231細胞功能的調(diào)節(jié),但只影響AKT通路,STAT3通路可能只受激酶活性調(diào)控。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

癌[37]、食管癌[38]、鼻咽癌[39]、胰腺癌[40]且和相關惡性腫瘤的增殖、侵襲及轉移正相關報道，乳腺癌化療前后組織中 TRPM7 的表達尚未RPM7 在乳腺癌組織中高表達，TRPM7 在乳腺癌化NA 在乳腺癌組織表達高于癌旁正常組織 M7 在乳腺癌組織中的表達情況，收集了 16 例乳旁正常組織，使用熒光定量 PCR 分析在乳腺癌M7 的 mRNA 的表達量：使用 Trizol 提取總 mRNA顯示，乳腺癌組織中 TRPM7 的 mRNA 表達量高于

安徽醫(yī)科大學博士學位論文PM7 的 mRNA 在乳腺癌化療后組織表達高于乳腺癌化療前組了解 TRPM7 在乳腺癌組織化療前后的表達情況，收集了 8 例乳腺癌組織，使用熒光定量 PCR 檢測在乳腺癌病人化療前后的乳腺癌的表達量：使用 Trizol 提取總 mRNA 后進行了熒光定量 PCR 檢測。乳腺癌組織中 TRPM7 的 mRNA 表達量明顯高于化療前（圖 2）。這一發(fā)生過程中可能扮演著重要角色，并且隨著乳腺癌化療而表達升高的化療耐藥有一定相關性。

38 圖 3：乳腺癌組織中 TRPM7 蛋白表達高于癌旁正常組織。 N 代表癌旁正常組織，M 代表乳腺癌癌組織，28 及 25 為組織編號 Fig 3： TRPM7 protein expresses higher in breast cancer tissues than paratumor normal tissues. N instead for paratumor normal tissues, M instead for cancer tissues. indicates statistical significance . 3.2 TRPM7 表達與乳腺癌患者的預后情況相關性分析基于以上實驗結果及 TRPM7 與多種惡性腫瘤的相關性，推測 TRPM7 與乳腺癌患者的預后間存在一定的相關性，于是在 The Cancer Genome Atlas（TCGA）中檢索 TRPM7 與患

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本文編號：2765911