【摘要】：胰腺癌和膽管癌是常見的惡性消化道腫瘤,由于早期診斷率低,大多數(shù)患者就診時(shí)已屬腫瘤晚期,缺乏有效的治療手段,存活率低,故提高胰腺癌和膽管癌早期診斷率和發(fā)現(xiàn)潛在的干預(yù)靶點(diǎn)尤其重要。N-糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要手段,導(dǎo)致細(xì)胞表面受體和粘附分子E-鈣聯(lián)素和整合素等各種糖蛋白功能的變化,這些變化與癌細(xì)胞的表型息息相關(guān)。而糖基化是由不同的糖基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生,糖基轉(zhuǎn)移酶的活性及其基因表達(dá)在癌癥等疾病中發(fā)生變化。因此,分析患者的N-糖組結(jié)構(gòu)及相應(yīng)糖基轉(zhuǎn)移酶的變化,有望找到惡性膽胰腫瘤的早期診斷標(biāo)志物,并發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶在膽胰惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。本研究對(duì)惡性膽胰腫瘤患者血清的N-糖組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,聯(lián)合現(xiàn)有臨床腫瘤標(biāo)志物,建立早期診斷模型。并對(duì)相應(yīng)糖基轉(zhuǎn)移酶在膽胰惡性腫瘤組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究,進(jìn)一步深入研究糖基轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)外對(duì)胰腺癌、膽管癌細(xì)胞系生物學(xué)功能的影響和相應(yīng)的機(jī)制,尋找潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。第一部分惡性膽胰腫瘤患者血清N-糖組分析目的:識(shí)別和驗(yàn)證基于N-糖組分析的生物標(biāo)志物,聯(lián)合現(xiàn)有臨床腫瘤標(biāo)志物,提高早期診斷率。方法:利用DSA-FACE技術(shù)分別對(duì)164例血清(包括72例胰腺癌、26例胰腺炎和66例性別、年齡相匹配的健康對(duì)照)、171例血清(包括59例膽管癌、32例膽管結(jié)石、20例膽管囊腫和60例健康對(duì)照)的N-糖組圖譜進(jìn)行分析,比較各組血清之間各峰值的差異,并通過logistic回歸法對(duì)差異的各峰值建立診斷模型,用ROC曲線評(píng)估診斷模型的診斷和鑒別診斷效應(yīng)。結(jié)果:一、胰腺癌部分:(1)相對(duì)于正常對(duì)照組,胰腺癌患者,四個(gè)N糖結(jié)構(gòu)(NGA2F,Peak1;NA3Fb,Peak 9;NA3Fc,Peak 10;NA4Fb,Peak 12)升高,三個(gè)N糖結(jié)構(gòu)(NG1A2F,Peak 4;NA2F,Peak 6;NA3,Peak 8)下降。(2)建立診斷模型Glyco PCtest=(peak 9+10+12/peak 4)。在胰腺癌建模組中診斷模型的ROC曲線下面積為0.859,最佳截?cái)嘀?cut-off值)為0.97時(shí)對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度分別為69.44%、89.39%。驗(yàn)證組中Glyco PCtest的靈敏度、特異度分別為75%,82.76%。(3)聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物CA19-9,建立診斷模型PCmodle=2.376Glyco PCtest+0.052CA19-9-4.075,建模組診斷的ROC曲線下面積為0.937,最佳截?cái)嘀禐?0.06對(duì)應(yīng)的靈敏度、特異度分別為80.56%、98.48%。驗(yàn)證組中靈敏度和特異度分別為91.67%、89.66%。診斷模型Glyco PCtest和PCmodle的靈敏度均較CA19-9、CEA對(duì)應(yīng)的靈敏度明顯升高。二、膽管癌部分:(1)相對(duì)于正常對(duì)照組,膽管癌患者,三個(gè)N糖結(jié)構(gòu)(NA3Fb,Peak 9;NA3Fc,Peak 10;NA4Fb,Peak 12)升高,兩個(gè)N糖結(jié)構(gòu)(NA2F,Peak 6;NA2FB,Peak 7)下降。(2)鑒別膽管癌和正常對(duì)照時(shí),建立診斷模型Glycomodel1=10.183Peak10+3.232Peak12+0.073CA19-9-8.381。診斷模型的ROC曲線下面積為0.977,最佳截?cái)嘀?cut-off值)為0.552時(shí)對(duì)應(yīng)的靈敏度和特異度分別為91.5%、98.3%。(3)區(qū)分膽管結(jié)石和膽管癌時(shí),建立診斷模型Glycomodel2=9.442Peak10+0.009CA19-9-4.390,診斷模型的ROC曲線下面積為0.925,最佳截?cái)嘀?cut-off值)為0.648對(duì)應(yīng)的靈敏度、特異度分別為81.4%、93.8%。(4)區(qū)分膽管囊腫和膽管癌時(shí),Peak10的ROC曲線下面積為0.923,最佳截?cái)嘀?cut-off值)為0.485對(duì)應(yīng)的靈敏度、特異度分別為71.2%、100%。結(jié)論:基于N-糖鏈的診斷模型可作為惡性膽胰腫瘤的非創(chuàng)傷性早期診斷標(biāo)志物,并且聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物CA19-9,可進(jìn)一步提高N-糖鏈的早期診斷效能。第二部分N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V在惡性膽胰腫瘤中的生物學(xué)功能及其機(jī)制研究目的:分析胰腺癌組織和癌旁組織中N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V(GNT-V)的表達(dá)情況,并對(duì)干擾GNT-V后胰腺癌和膽管癌細(xì)胞系的生物學(xué)功能變化和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究,為惡性膽胰腫瘤的干預(yù)和臨床意義詮釋提供依據(jù)。方法:利用RT-PCR法對(duì)19對(duì)胰腺癌組織和癌旁組織中GNT-V的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。分別構(gòu)建干擾GNT-V和對(duì)照NC的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系Bx PC-3、ASPC-1、PANC-1、CFPAC-1和膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810,通過流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn),觀察GNT-V的表達(dá)對(duì)胰腺癌、膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及細(xì)胞周期的影響。利用WB檢測(cè)干擾GNT-V后的細(xì)胞磷酸化蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:一、胰腺癌部分:(1)RT-PCR結(jié)果顯示,GNT-V在胰腺癌組織中的表達(dá)相對(duì)于癌旁組織顯著降低。(2)對(duì)敲低GNT-V和對(duì)照NC的胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行比較研究,結(jié)果表明敲低GNT-V促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)敲低GNT-V細(xì)胞S期顯著升高。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)表明干擾GNT-V后促進(jìn)皮下腫瘤的生長、增殖。(3)觀察敲低干擾GNT-V和對(duì)照NC的胰腺癌細(xì)胞中的磷酸化蛋白變化,表明敲低GNT-V后細(xì)胞中p-P38MAPK明顯升高。二、膽管癌部分:(1)對(duì)敲低干擾GNT-V和對(duì)照NC的膽管癌細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行研究,結(jié)果表明敲低GNT-V抑制膽管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。(2)觀察轉(zhuǎn)染干擾GNT-V和對(duì)照NC的膽管癌細(xì)胞中的磷酸化蛋白變化,表明干擾GNT-V后細(xì)胞中p-SAPK/JNK明顯升高。結(jié)論:GNT-V對(duì)惡性膽胰腫瘤的增殖、遷移、侵襲具有重要的生物學(xué)意義,但在胰腺癌和膽管癌中的作用不一致,并且在胰腺癌和膽管癌中分別通過不同的信號(hào)通路發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735;R730.43

【共引文獻(xiàn)】

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