【摘要】：隨著分子水平上對(duì)基因的深入研究,單個(gè)基因呈現(xiàn)出復(fù)雜的生物學(xué)功能。部分基因的可變表達(dá)形式在控制發(fā)育分化方面的作用已經(jīng)較為清晰,但在癌癥發(fā)生過程中的作用尚不清楚。OCT4作為ES細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子,其在癌細(xì)胞中的表達(dá)已基本得到確認(rèn)。之前研究證實(shí),OCT4B變體表達(dá)于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7,但功能尚不明確。本論文將繼續(xù)探究OCT4B在乳腺癌細(xì)胞中具有的生物學(xué)功能及其可能的調(diào)控途徑。并首次發(fā)現(xiàn)了四種與OCT4B密切相關(guān)的新p53變體(p53variants),初步研究了這幾種變體在不同細(xì)胞系中的表達(dá)調(diào)控關(guān)系,為正常成體細(xì)胞變異、癌化、癌細(xì)胞基因治療提供了理論基礎(chǔ)。1)通過對(duì)四種不同的人乳腺癌細(xì)胞系中OCT4表達(dá)的檢測明確其在癌細(xì)胞中可能的意義。檢測發(fā)現(xiàn)OCT4B普遍表達(dá)于人乳腺癌細(xì)胞中,此外干細(xì)胞的關(guān)鍵基因OCT4A在四種乳腺癌細(xì)胞中也有不同程度的表達(dá)。暗示OCT4基因的激活尤其是OCT4B的表達(dá)可能對(duì)于乳腺癌的發(fā)生或發(fā)展具有特定意義。2)通過RT-PCR和Real-time PCR檢測了解OCT4B在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中對(duì)癌癥相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。檢測發(fā)現(xiàn)OCT4B與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的途徑密切相關(guān),過表達(dá)OCT4B能夠明顯上調(diào)原癌基因Bcl-2的表達(dá),因此推測OCT4B可能具有類似于原癌基因的功能。進(jìn)一步利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源的OCT4B下調(diào)時(shí)癌細(xì)胞出現(xiàn)大量的凋亡,并且細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G1期阻抑。這個(gè)結(jié)果表明,OCT4B具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡的功能。3)OCT4的兩種剪切形式在人乳腺癌細(xì)胞中都能表達(dá),二者間是否能夠相互調(diào)節(jié),對(duì)于真正了解OCT4B在癌細(xì)胞中的功能至關(guān)重要。研究表明,過表達(dá)外源OCT4B可以上調(diào)MCF-7細(xì)胞的內(nèi)源OCT4A表達(dá)。同樣的,外源OCT4A對(duì)OCT4B的表達(dá)也起到一定上調(diào)的作用,但其對(duì)于p53、Bcl-2的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及OCT4B作用明顯。結(jié)果表明,癌細(xì)胞中OCT4B有著相對(duì)獨(dú)立的重要功能。4)發(fā)現(xiàn)一種與OCT4B正相關(guān)的新p53變體(p53i8,后更名為p53i8ε)。該變體mRNA序列包含野生型p53完整的第八內(nèi)含子序列,缺失了野生型p53所具有的核定位信號(hào)、核轉(zhuǎn)移信號(hào)和寡聚化結(jié)構(gòu)域。過表達(dá)p53i8ε能明顯上調(diào)Bcl-2/BAX的比率。并且該變體受OCT4B正調(diào)節(jié)。推測OCT4B的功能途徑是通過調(diào)節(jié)p53可變表達(dá),利用p53i8ε來上調(diào)Bcl-2表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌增殖、抑制凋亡。5)進(jìn)一步探索p53復(fù)雜功能與p53不同變體的關(guān)系。在MCF-7中發(fā)現(xiàn)另外四種新的p53剪切變體,根據(jù)序列特點(diǎn)分別命名為p53i7η、p53i8ε(即p53i8)、p53i8ζ和p53i9δ,以及一種缺失型的變體p53e5d。這些變體編碼的蛋白都具有完整的p53 N-端結(jié)構(gòu)域。研究分析了不同細(xì)胞系及組織中p53變體的表達(dá)特點(diǎn)及功能,發(fā)現(xiàn)部分變體受OCT4B表達(dá)調(diào)節(jié),為今后深入研究OCT4B與p53變體在癌細(xì)胞中的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本論文的研究發(fā)現(xiàn)為基因組上單個(gè)基因的表達(dá)與功能多樣性提供了直接證據(jù)。揭示了OCT4基因變體與p53基因變體之間存在著特定的功能聯(lián)系。為細(xì)胞轉(zhuǎn)化／癌變提供新的檢測手段,為癌癥基因治療提供了新的研究方向。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2
【圖文】：

過轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)的檢測，確定了本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建干涉載體的有效性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)外逡逑源０ＣＴ４Ｂ時(shí)，檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和蛋白水平０ＣＴ４Ｂ都明顯提高；轉(zhuǎn)染ＯＣＴ４干涉載體后，內(nèi)源０ＣＴ４逡逑表達(dá)量明顯下調(diào)（如圖２－１２Ａ和１２Ｂ）。逡逑５５逡逑

序列具有與ＦＬｐ５３（野生型全長ｐ５３）完全相同５’端序列，但不同在于，在第８外顯子的后面多出逡逑了一段９２ｂｐ的序列，經(jīng)比對(duì)是化－ｐ５３基因的全部第８內(nèi)含子的序列，故暫將此ｐ５３變體命名為逡逑ｐ５３巧（如圖２－１８）。由于這段保留的內(nèi)含子序列在其最后會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的終止密碼子ＴＡＱ使所編逡逑碼ｐ５３ｉ８蛋白的失去了全部Ｃ端功能域，包括核定位信號(hào)、核運(yùn)輸信號(hào)等（如圖２－１９），意味著逡逑ｐ５３巧可能失去了邋ＦＬｐ５３的原有的轉(zhuǎn)錄因子功能。逡逑Ｐ邋巧識(shí)（｜Ｃ邐ｐ５３ｑ逡逑■邐ＥＭＩＲＭＨｌ］——ＩＭＭ－逡逑Ｉ邋向邐ｉｉ＊）＜逡逑Pt…８）擊８逡逑圖２－１７ｐ巧ｉＳＰＣＲ引物位ａ逡逑ｐ５３為通用引物，ｐ５３邋（ｅ４－ｉ８）為新變體特異引物。ｐ５３巧ｑｃ為ｐ５３舊特異性黃化定量ＰＣＲ引物，ｐ５３ｑ為通用費(fèi)化定量逡逑ＰＣＲ引物。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１７邋Ｔｈｅ邋ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐ５３邋ｐｒｉｍｅｒｓ．逡逑ｐ５３邋ｉｓ邋ｕｎｉｖｅｒｓａｌ邋ｐｄｍｅｒｓ、ｐＷ邋（ｅ４－ｉ８）邋ｉｓ邋化ｅ邋ｎｅｗ邋ｖａｒｉａｎｔ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｐｒｉｍｅｒｓ．邋ｐ５引８ｑｃ邋ｉｓ邋化ｅ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣ民邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｏｆ逡逑ｐ５３ｉ８，邋ｐ５３ｑ邋ｉｓ邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｉｍｅｒｓ．逡逑６２逡逑

過轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)的檢測，確定了本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建干涉載體的有效性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)外逡逑源０ＣＴ４Ｂ時(shí)，檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和蛋白水平０ＣＴ４Ｂ都明顯提高；轉(zhuǎn)染ＯＣＴ４干涉載體后，內(nèi)源０ＣＴ４逡逑表達(dá)量明顯下調(diào)（如圖２－１２Ａ和１２Ｂ）。逡逑５５逡逑

本文編號(hào)：2764243