【摘要】：背景:原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤,亞洲、非洲和南部歐洲都是其高發(fā)地區(qū),其中中國的病例占全球肝癌病例的50%以上。肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在原發(fā)性肝癌中最為常見,其惡性程度高、發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),目前的治療方案主要以手術(shù)為主的綜合治療。但大多數(shù)肝細(xì)胞肝癌患者在確診時(shí)已處于晚期,無法行手術(shù)治療,總體預(yù)后不良。二甲雙胍目前臨床應(yīng)用最廣泛的口服降糖藥之一,越來越多的流行病學(xué)證據(jù)表明二甲雙胍與各種癌癥風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān),最近的研究證實(shí)二甲雙胍對(duì)肝細(xì)胞癌(HCC)具有抗腫瘤作用。然而,其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。目的:研究二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響,尋找二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡影響的分子途徑及可能的作用機(jī)制,為發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標(biāo)記物、改善肝細(xì)胞肝癌的早期診斷及治療提供新思路。方法:1.CCK-8(cell counting kit-8)及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖及凋亡的影響,Real-time PCR檢測miR-378、CDK1 m RNA的表達(dá)水平的變化,Western blot檢測CDK1蛋白表達(dá)水平的變化。2.體外轉(zhuǎn)染miR-378 mimic以過表達(dá)miR-378,Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。通過CCK-8及流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)miR-378對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期的影響。3.生物信息學(xué)預(yù)測CDK1與miR-378可能存在的結(jié)合位點(diǎn)并構(gòu)建CDK13’-UTR區(qū)域啟動(dòng)子表達(dá)載體,用螢光素酶報(bào)告基因方法進(jìn)行驗(yàn)證。通過Real-time PCR與Western blot檢測過表達(dá)miR-378對(duì)CDK1 m RNA及其蛋白表達(dá)水平的影響。4.通過Real-time PCR檢測通過轉(zhuǎn)染技術(shù)小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-378的效率,Western blot技術(shù)檢測小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-378對(duì)CDK1 m RNA和蛋白表達(dá)水平的影響。5.通過Western blot、CCK-8及流式細(xì)胞法觀察miR-378 inhibitor能否逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對(duì)CDK1表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果:1.二甲雙胍抑制HCC細(xì)胞增殖伴隨CDK1 m RNA和蛋白表達(dá)水平的降低和miR-378表達(dá)水平的上調(diào)。2.體外過表達(dá)miR-378抑制HCC細(xì)胞增殖。3.miR-378通過靶向CDK1 3'-UTR區(qū)域而直接抑制其表達(dá)。4.體內(nèi)過表達(dá)miR-378能抑制腫瘤生長并下調(diào)CDK1的表達(dá)水平。5.二甲雙胍通過促進(jìn)HCC細(xì)胞中的miR-378水平抑制CDK1表達(dá)和細(xì)胞增殖。結(jié)論:二甲雙胍誘導(dǎo)miR-378靶向下調(diào)CDK1水平并抑制肝細(xì)胞肝癌的細(xì)胞增殖。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7
【圖文】：

40圖 3. MiR-378 通過靶向其 3'-UTR 直接抑制 CDK1 的表達(dá)。（A 和 B） miRNA 預(yù)測網(wǎng)站和雙熒光素酶報(bào)告基因測定結(jié)果顯示miR-378和CDK1之間的結(jié)合位點(diǎn)。（C和D）miR-378過表達(dá)降低了 CDK1 mRNA 和蛋白質(zhì)水平。數(shù)據(jù)表示為 mean±SD，n = 3，*P <0.05。3.4 討論CDK 即周期蛋白依賴性蛋白激酶，是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，CDK可以和 cyclin 結(jié)合形成異二聚體，其中 cyclin 為調(diào)節(jié)亞基，CDK 為催化亞基，不同的復(fù)合物，通過 CDK 活性，催化不同底物磷酸化，而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期不同

南京醫(yī)科大學(xué)博士畢業(yè)論文我們用 Real-time PCR 法檢測了 mimic 組和 NC 組的腫瘤組織中 miR-378 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mimic 組瘤組織中 miR-378 的表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著上調(diào)（圖 4C）。4.3.3 Western blot 檢測 miR-378 mimic 組腫瘤組織中 CDK1 表達(dá)水平我們提取了瘤組織總蛋白，Western blot 結(jié)果顯示，與體外結(jié)果相一致，miR-378 mimic 組瘤組織中 CDK1 的蛋白表達(dá)水平較 NC 組相比顯著下調(diào)（圖 4D）。

miR-378-inhibitor 轉(zhuǎn)染的 HepG2 細(xì)胞的增殖速率與正常肝癌細(xì)胞增殖速度相似。這表明，HepG2 細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍培養(yǎng)引起的細(xì)胞增殖抑制被轉(zhuǎn)染 miR-378inhibitor 后逆轉(zhuǎn)（圖 5B）。5.3.3 細(xì)胞周期測定分析 miR-378 inhibitor 對(duì)細(xì)胞增殖影響二甲雙胍可以引起 HepG2 細(xì)胞 G2/M 期周期阻滯顯著增強(qiáng)，而給予miR-378-inhibitor 轉(zhuǎn)染后能逆轉(zhuǎn)由二甲雙胍引起的 G2/M 阻滯（19%-10.4%）（圖5C）。5.3.4 細(xì)胞凋亡分析 miR-378 inhibitor 對(duì)細(xì)胞增殖影響二甲雙胍可以引起 HepG2 細(xì)胞凋亡率顯著上調(diào)，而給予 miR-378 inhibitor轉(zhuǎn)染后則不能逆轉(zhuǎn)由 miR-378 inhibitor 引起的細(xì)胞凋亡（圖 5D）。

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本文編號(hào)：2763120