【摘要】：研究背景:毛囊位于體表,是皮膚的附屬器之一,常常受到外界環(huán)境中物理、化學(xué)和生物因素的作用,而發(fā)生病理改變,如:脫發(fā)和失去色素。研究表明毛囊中含有間充質(zhì)干細(xì)胞(Human hair follicle-derived mesenchymal stem cells,hHF-MSCs)、黑色素干細(xì)胞、神經(jīng)嵴干細(xì)胞和角朊干細(xì)胞。這些干細(xì)胞在時(shí)空上協(xié)同作用,維持毛囊的自我更新和毛囊周期的正常運(yùn)行。同其它來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)類似,hHF-MSCs表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105,具有成骨、成脂和成軟骨分化潛能。我們成功地利用人毛囊來(lái)源干細(xì)胞原位修復(fù)了慢性皮膚潰瘍,治愈了白癜風(fēng),構(gòu)建了組織工程小口徑血管,制備出表達(dá)產(chǎn)物釋放可控轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞,成功地逆轉(zhuǎn)了糖尿病高血糖。盡管干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的作用越來(lái)越引起世人的關(guān)注,但干細(xì)胞的安全性、有效性和倫理是干細(xì)胞生物學(xué)與再生醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用不可回避的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。特別是干細(xì)胞的安全性問(wèn)題一直備受醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注~([1])。研究發(fā)現(xiàn),MSCs通過(guò)分泌免疫因子和炎癥因子,抑制或促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。但hHF-MSCs是否通過(guò)旁分泌,具有促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)作用,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。毛囊干細(xì)胞來(lái)源豐富、獲取方便且可重復(fù)獲取等優(yōu)勢(shì),成為組織修復(fù)、器官重建和基因治療重要的種子細(xì)胞來(lái)源。為了發(fā)揮毛囊干細(xì)胞來(lái)源優(yōu)勢(shì),充分利用毛囊干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中作用,探究毛囊干細(xì)胞促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)作用具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。Toll樣受體(TLRs)是指免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞在質(zhì)膜或細(xì)胞內(nèi)(內(nèi)小體)表達(dá)的Ⅰ型膜蛋白。免疫細(xì)胞指的是T、B細(xì)胞以及固有免疫細(xì)胞(主要包括單核/巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等)。非免疫細(xì)胞指各種上皮、內(nèi)皮細(xì)胞、MSCs等等~([1])。雖然TLRs在免疫系統(tǒng)廣泛分布,但是不同來(lái)源細(xì)胞的TLRs表達(dá)水平并不相同。研究表明人脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞(AT-MSCs)和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)表達(dá)TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6和TLR9。雖然BM-MSCs和AT-MSCs均表達(dá)TLR4,但臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Wharton Jelly-derived stem cells,WJ-MSCs)缺乏TLR4的表達(dá)~([2-5])。一些配體可以特異性與TLRs結(jié)合受體,激活其下游通路,產(chǎn)生活性氧(ROS)的、釋放細(xì)胞因子,進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。通過(guò)利用Poly I:C激活TLR3受體,使MSCs向MSC2表型極化,釋放抗炎因子IL4、IL10、CSF1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3,維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定;利用脂多糖LPS激活TLR4受體,使MSCs向MSC1表型極化,釋放促炎因子IL6、CXCL8、IL1β、TNFα引起局部炎癥反應(yīng),殺滅、清除炎癥部位的病原體及異物等。由此可見(jiàn)利用外來(lái)配體與MSCs上TLR3和TLR4特異性結(jié)合,來(lái)間接調(diào)控微環(huán)境,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡~([6-8])。鑒于MSCs的極化與TLRs表達(dá)有關(guān),我們以體外誘導(dǎo)hHF-MSCs表達(dá)TLR4或TLR3,使其極化為hHF-MSC1和hHF-MSC2為出發(fā)點(diǎn),探討極化后的hHF-MSCs是否具有抑制或者促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞(B16)增殖或凋亡作用。目的:體外誘導(dǎo)HF-MSCs向hHF-MSC1或hHF-MSC2極化,探討hHF-MSC1或和hHF-MSC2對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞增殖和凋亡作用。方法:1.通過(guò)直接拔取志愿者毛發(fā)的方式獲取毛囊的方法,獲得hHF-MSCs。采用免疫熒光染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù),檢測(cè)hHF-MSCs表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD90、CD105的表達(dá)。利用油紅O和茜素紅染色檢染色檢測(cè)hHF-MSCs的成脂、成骨分化潛能。2.通過(guò)分別與LPS和Poly I:C作用,誘導(dǎo)hHF-MSCs極化為hHF-MSC1和hHF-MSC2。采用細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)以及Western blot檢測(cè)hHF-MSC1和hHF-MSC2上TLR3和TLR4表達(dá)。利用PCR技術(shù)檢測(cè),在mRNA水平檢測(cè)hHF-MSC1或hHF-MSC2促炎癥因子和抗炎癥因子表達(dá)。利用MTT和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)hHF-MSC1和hHF-MSC2細(xì)胞增殖和周期的改變,并與hHF-MSCs比較。3.將hHF-MSC1或hHF-MSC2的上清與B16細(xì)胞共培養(yǎng)。利用MTT和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)hHF-MSC1或hHF-MSC2上清對(duì)黑色素瘤B16增殖和凋亡影響。結(jié)果:1.hHF-MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定通過(guò)直接拔取志愿者頭部后枕部毛囊,獲得hHF-MSCs。顯微鏡下觀測(cè)hHF-MSCs呈長(zhǎng)梭形,魚(yú)群樣生長(zhǎng)。免疫熒光染色以及流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hHF-MSCs表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105,不表達(dá)CD31。油紅O及茜素紅染色顯示,hHF-MSCs具有成脂、成骨分化潛能。2.毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞極化及相關(guān)炎癥因子的檢測(cè)在LPS或Poly I:C作用下,hHF-MSCs極化成hHF-MSC1或hHF-MSC2。免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn):在LPS或Poly I:C作用下,hHF-MSCs表達(dá)TLR4或TLR3的百分比增加,與未極化組比,具有顯著性差異。Western blot結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果類似。PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS和Poly I:C分別上調(diào)促炎因子IL6、CXCL8、IL1β、TNFα和抗炎因子IL10、CSF1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3的表達(dá)。QPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS和Poly I:C分別上調(diào)促炎因子CXCL8、TNFα和抗炎因子IL10、TGFβ1的表達(dá)。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在給定的劑量下,LPS和Poly I:C對(duì)hHF-MSCs增殖影響與對(duì)照組比無(wú)顯著差異。3.毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞極化對(duì)黑色素瘤B16增殖凋亡的影響收集hHF-MSC1、hHF-MSC2、hHF-MSCs的同化培養(yǎng)基,與黑色素瘤細(xì)胞B16共培養(yǎng)。MTT和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hHF-MSC1同化培養(yǎng)基抑制黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡;而hHF-MSC2同化培養(yǎng)基促進(jìn)黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖,抑制其凋亡,與hHF-MSCs同化培養(yǎng)基比,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:通過(guò)LPS或Poly I:C誘導(dǎo)hHF-MSCs向hHF-MSC1或hHF-MSC2極化。hHF-MSC1或hHF-MSC2通過(guò)旁分泌作用抑制小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡作用或促進(jìn)B16細(xì)胞增殖,抑制其凋亡。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.5
【圖文】：

18.2 hHF-MSCs 的鑒定.2.1 hHF-MSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)（細(xì)胞免疫熒光）細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示， hHF-MSCs 表達(dá) CD105、CD90、CD73 和44，不表達(dá) CD31。結(jié)果圖 2 所示。第 8 代 hHF-MSCs第 8 代 hHF-MSCsA.通過(guò)拔取志愿者毛發(fā)，采用組織塊發(fā)培養(yǎng) hHF-MSCs 6 天后，有成纖維樣細(xì)胞爬出(100養(yǎng)后 hHF-MSCs 呈長(zhǎng)梭形，魚(yú)群樣排列。培養(yǎng)第 8 代 hHF-MSCs(B.40×C.100×)

1.3.2.2 hHF-MSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)（流式細(xì)胞術(shù)）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，hHF-MSCs 表達(dá) CD44、CD90、CD105 和 CD73，陽(yáng)性率分別為 86.94%、89.58%、91.25%、 89.86%，而基本不表達(dá) CD31 內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，如圖 3 所示。圖 2 免疫熒光顯示 hHF-MSCs 表達(dá) CD44、CD90、CD73、CD105, 不表達(dá) CD31（100×）

1.3.2.2 hHF-MSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)（流式細(xì)胞術(shù)）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，hHF-MSCs 表達(dá) CD44、CD90、CD105 和 CD73，陽(yáng)性率分別為 86.94%、89.58%、91.25%、 89.86%，而基本不表達(dá) CD31 內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，如圖 3 所示。圖 2 免疫熒光顯示 hHF-MSCs 表達(dá) CD44、CD90、CD73、CD105, 不表達(dá) CD31（100×）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Martha L Arango-Rodriguez;Fernando Ezquer;Marcelo Ezquer;Paulette Conget;;Could cancer and infection be adverse effects of mesenchymal stromal cell therapy?[J];World Journal of Stem Cells;2015年02期

2 Pranela Rameshwar;;Would cancer stem cells affect the future investment in stem cell therapy?[J];World Journal of Experimental Medicine;2012年02期

3 王青云;;細(xì)胞與疾病的關(guān)系[J];中國(guó)社區(qū)醫(yī)師(綜合版);2007年02期

本文編號(hào)：2757444