【摘要】：目的:研究細(xì)胞縫隙連接通訊(Gap junction intercellular communication,GJIC)在腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)調(diào)控非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)惡性進(jìn)展中的作用及其機(jī)制。方法:1.采用組織塊貼壁培養(yǎng)法從原發(fā)性NSCLC患者手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織標(biāo)本分別分離原代CAFs細(xì)胞和配對(duì)正常成纖維細(xì)胞(Normal fibroblasts,NFs);通過(guò)免疫印跡(Western blot,WB)和免疫熒光檢測(cè)CAFs標(biāo)記物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、成纖維細(xì)胞活化蛋白-α(Fibroblast activation protein-α,FAP-α)的表達(dá)水平,通過(guò)膠原收縮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAFs的膠原收縮能力。2.用綠色熒光(GFP)標(biāo)記NSCLC細(xì)胞株A549和H1299,構(gòu)建CAFs和NSCLC-GFP細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)體系,并用流式細(xì)胞儀(Flow cytometer,FCM)分選帶GFP的NSCLC和陰性的CAFs細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.通過(guò)WB、劃痕法和Transwell小室法分別檢測(cè)與CAFs共培養(yǎng)后NSCLC細(xì)胞的E-鈣粘蛋白(E-caherin)和N-鈣粘蛋白(N-cadherin)的蛋白表達(dá)水平、遷移能力和侵襲能力。4.使用細(xì)胞接種熒光示蹤法(Parachute assay)檢測(cè)CAFs同種細(xì)胞間、NSCLC同種細(xì)胞間以及CAFs與NSCLC異種細(xì)胞間的GJIC;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,q RT-PCR)、WB和免疫熒光分別檢測(cè)在哺乳動(dòng)物肺組織或細(xì)胞表達(dá)的四種主要的縫隙連接蛋白(Connexins,Cxs)亞型Cx26,Cx32,Cx31.1和Cx43在CAFs和NSCLC細(xì)胞上的m RNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位。5.構(gòu)建Cx43慢病毒過(guò)表達(dá)載體(Ubi-MCS-EGFP-IRES-puromycin)及Cx43慢病毒干擾載體(h U6-MCSubiquitin-EGFP-IRES-puromycin),再分別感染CAFs和NSCLC細(xì)胞,然后用梯度濃度的嘌呤霉素連續(xù)作用篩選2周,篩選出穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Cx43的細(xì)胞株和穩(wěn)定干擾Cx43表達(dá)的細(xì)胞株,WB檢測(cè)上述細(xì)胞中Cx43的蛋白表達(dá)水平。6.在CAFs及NSCLC細(xì)胞中分別使用GJIC抑制劑18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid,18α-GA,4μM)或GJIC增強(qiáng)劑全反式維甲酸(All-trans-retinoic acid,RA,1μM)預(yù)處理48小時(shí),再用Parachute assay檢測(cè)上述CAFs與NSCLC細(xì)胞間的GJIC,并分別與同時(shí)在CAFs和NSCLC細(xì)胞上干擾或過(guò)表Cx43后的GJIC比較。7.劃痕法和Transwell小室法分別檢測(cè)與CAFs共培養(yǎng)后NSCLC細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力;用WB檢測(cè)與CAFs共培養(yǎng)后NSCLC細(xì)胞中EMT轉(zhuǎn)化中上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-caherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin的蛋白表達(dá)情況和PI3K/AKT、MAPK/ERK信號(hào)通路的磷酸化水平。8.劃痕法和Transwell小室法分別檢測(cè)使用抑制劑LY294002和U0126分別抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路后,NSCLC細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。結(jié)果:1.光鏡下顯示,CAFs、NFs形態(tài)相似,均呈典型成纖維細(xì)胞狀態(tài),表現(xiàn)為梭形,細(xì)胞體積較大,核小,核仁不明顯,胞質(zhì)少;WB結(jié)果顯示,相比配對(duì)NFs,CAFs高表達(dá)其標(biāo)志物α-SMA和FAP-α;免疫熒光也顯示,相比配對(duì)NFs,CAFs細(xì)胞高表達(dá)其標(biāo)志物α-SMA和FAP-α;膠原收縮實(shí)驗(yàn)顯示,相比配對(duì)NFs,CAFs細(xì)胞有較強(qiáng)的膠原收縮能力。2.光鏡下顯示,與CAFs共培養(yǎng)后,NSCLC細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞的鵝卵石形態(tài),變得明顯拉長(zhǎng)、細(xì)胞間連接變疏松;WB結(jié)果顯示,與CAFs共培養(yǎng)后,NSCLC細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng);Transwell小室法和劃痕法結(jié)果也顯示,與CAFs共培養(yǎng)后,NSCLC細(xì)胞侵襲、遷移能力增強(qiáng)。3.Parachute assay結(jié)果顯示,CAFs、NSCLC細(xì)胞均能有效傳遞熒光染料Calcein-AM到周圍同種細(xì)胞(平均傳遞細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為:10.33±1.53(SD),11.33±3.06(SD)和12.00±3.61(SD))。尤其是CAFs能傳遞Calcein-AM給NSCLC細(xì)胞(平均傳遞細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為:20.67±3.229(SD)或24.00±2.65(SD))。但NSCLC均無(wú)法傳遞Calcein-AM給CAFs。4.q RT-PCR、WB結(jié)果顯示,在CAFs和NSCLC細(xì)胞中,Cx26和Cx43是主要表達(dá)的Cxs亞型。免疫熒光結(jié)果顯示,Cx43蛋白聚集在CAFs的胞膜和NSCLC細(xì)胞的胞膜及胞漿,而Cx26、Cx31.1及Cx32蛋白聚集在CAFs和NSCLC細(xì)胞的胞漿。5.Parachute assay結(jié)果表明,干擾CAFs和/或NSCLC細(xì)胞的Cx43表達(dá),能夠顯著減少?gòu)腃AFs到NSCLC細(xì)胞的單向GJIC;相反,過(guò)表達(dá)CAFs和/或NSCLC細(xì)胞的Cx43表達(dá),能夠顯著增加從CAFs到NSCLC細(xì)胞的單向GJIC。此外,相比單獨(dú)在CAFs或單獨(dú)在NSCLC細(xì)胞過(guò)表達(dá)Cx43表達(dá),在CAFs和NSCLC細(xì)胞共同過(guò)表達(dá)Cx43能進(jìn)一步增強(qiáng)CAFs到NSCLC的單向GJIC。6.WB、劃痕法和Transwell小室法顯示,使用GJIC抑制劑18α-GA 4μM預(yù)處理CAFs和NSCLC細(xì)胞48小時(shí)(抑制GJIC而不影響CX43蛋白表達(dá)水平)可明顯逆轉(zhuǎn)CAFs誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲能力,并且這種抑制作用與在同時(shí)干擾CAFs和NSCLC細(xì)胞同時(shí)干擾Cx43(抑制GJIC并抑制CX43蛋白表達(dá))程度相似。另一方面,使用GJIC增強(qiáng)劑RA 1μM預(yù)處理CAFs和NSCLC細(xì)胞48小時(shí)(增強(qiáng)GJIC而不影響CX43蛋白表達(dá)水平)可明顯增加CAFs誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲能力,并且這種增強(qiáng)作用與在CAFs和NSCLC細(xì)胞同時(shí)過(guò)表達(dá)Cx43(增強(qiáng)GJIC并增強(qiáng)CX43蛋白表達(dá))程度相似。7.WB結(jié)果顯示,相比單獨(dú)培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞,與CAFs共培養(yǎng)后NSCLC細(xì)胞的磷酸化Akt和ERK水平明顯增強(qiáng);分別在CAFs和NSCLC細(xì)胞同時(shí)干擾Cx43抑制GJIC或在CAFs和NSCLC細(xì)胞同時(shí)過(guò)表達(dá)Cx43增強(qiáng)GJIC后,與CAFs共培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞分別呈現(xiàn)磷酸化Akt和ERK水平的減弱和增強(qiáng)。8.劃痕法和Transwell小室法顯示顯示,分別使用抑制劑LY294002和U0126抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路后,均可抑制NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲能力并且抑制程度相似;聯(lián)合使用兩種抑制劑LY294002和U0126可協(xié)同降低NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲能力。結(jié)論:Cx43組成的CAFs到NSCLC細(xì)胞的單向GJIC介導(dǎo)了CAFs調(diào)控NSCLC細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化、侵襲和遷移,其機(jī)制與CAFs通過(guò)GJIC依賴的方式激活NSCLC細(xì)胞的PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2
【圖文】：

從我校附屬腫瘤醫(yī)院胸瘤外科的原發(fā)性NSCLC患者手術(shù)切除組織中分別分離CAFs 、NFs進(jìn)行原代培養(yǎng)和鑒定。成纖維細(xì)胞有選擇性優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，經(jīng)0.25%胰酶消化傳代2次后，可獲得純化的CAFs和NFs細(xì)胞。如圖1-1所示，純化后的CAFs、NFs呈典型成纖維細(xì)胞狀態(tài)，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)梭形，細(xì)胞體積較大，核小，核仁不明顯，胞質(zhì)少； Western blot和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，相比配對(duì)NFs，CAFs高表達(dá)其標(biāo)志物α-SMA和FAP-α（P<0.01）見(jiàn)圖1-1和圖1-2，CAFs上述效應(yīng)可以至少維持至5代（結(jié)果未展示）。膠原收縮實(shí)驗(yàn)顯示，CAFs有較強(qiáng)的膠原收縮功能（n為患者標(biāo)本編號(hào)

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本文編號(hào)：2738510