【摘要】：目的:宮頸癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤,不斷威脅著女性的生命健康。人乳頭瘤病毒16型(HPV16)被認為是宮頸癌最主要的外源性致病因素,其中E6癌基因在抑制細胞凋亡,干擾染色體穩(wěn)定性,影響信號通路,以及免疫逃逸等方面起重要作用。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是上皮細胞間粘附連接的重要分子,該基因表達沉默會引起上皮細胞表型和侵襲能力的改變。本課題組前期實驗已證實,宮頸鱗癌組織中HPV16E6蛋白高表達與E-cadherin基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化及E-cadherin蛋白表達下調(diào)有關。那么,HPV引起宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是否通過E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化的調(diào)節(jié)而致病仍有待研究。本實驗通過構建HPV16E6基因shRNA慢病毒載體,感染宮頸癌SiHa細胞,篩選建立穩(wěn)定細胞系,觀察基因沉默后E-cadherin表達及基因啟動子甲基化的情況,觀察其細胞生物學功能。初步研究分析HPV16E6對E-cadherin基因高甲基化的作用機制,為宮頸癌的基因治療尋找有效靶點。方法1、培養(yǎng)宮頸癌SiHa細胞系,構建HPV16E6基因shRNA慢病毒沉默載體質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞獲取陽性克隆,進行PCR擴增測序。將病毒載體共轉(zhuǎn)染到293T細胞進行包裝,測定病毒滴度,用嘌呤霉素篩選建立沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。2、設置shRNA E6沉默組、空載體組、空白對照組。RT-q PCR檢測HPV16E6、E-cadherin mRNA表達情況,Western Blot檢測HPV16E6基因沉默后蛋白表達情況,CCK-8法及劃痕實驗檢測SiHa細胞增殖遷移能力,甲基化特異性PCR(MSP)檢測E-cadherin基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況。結果1、測序結果證明已成功構建HPV16E6 shRNA慢病毒沉默質(zhì)粒,熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光,檢測包裝純化后的慢病毒滴度為5×108TU/ml,經(jīng)嘌呤霉素穩(wěn)篩后shRNA E6組HPV16E6 mRNA水平較另兩組明顯下降(P0.01),提示已成功篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。2、shRNA E6組的E-cadherin mRNA及蛋白表達水平較另兩組顯著上調(diào)(P0.01),而空載體組及空白組間差異無統(tǒng)計學意義,同時shRNA E6組SiHa細胞的增殖及遷移能力均較另兩組明顯減弱(P0.05)。3、shRNA E6組SiHa細胞中的E-cadherin基因非甲基化擴增呈陽性,甲基化擴增產(chǎn)物強度較空載體組及空白對照組明顯減弱,而空載體組及空白對照組SiHa細胞中的E-cadherin呈完全甲基化狀態(tài)。結論1、成功構建的shRNA慢病毒沉默載體能夠有效沉默HPV16E6基因表達。2、沉默HPV16E6基因上調(diào)宮頸癌SiHa細胞E-cadherin的表達水平,降低了SiHa細胞的增殖及遷移能力,同時下調(diào)E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化水平,該甲基化狀態(tài)的改變導致了E-cadherin重新表達。
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

1 王淑琴;黃利鳴;陳建玲;韓鈺;;宮頸癌組織中E-鈣粘素基因5'端CpG島甲基化與蛋白表達的關系[J];中國婦幼保健;2014年25期

2 紀莎;瑪依努爾·尼牙孜;;DNA甲基化與宮頸癌研究進展[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2014年03期

3 葛艷;楊永秀;胡樂;劉暢;朱駿;;Twist2和E-cadherin在宮頸鱗癌中的表達及意義[J];國際婦產(chǎn)科學雜志;2014年01期

4 Hui-Juan Yang;;Aberrant DNA methylation in cervical carcinogenesis[J];Chinese Journal of Cancer;2013年01期

5 尋鳳華;熊正文;李宏偉;黃勇;張華東;;Snail、E-cadherin mRNA在宮頸病變中的表達及臨床意義[J];中國婦幼保健;2011年28期

6 ;RNA interference of pax2 inhibits growth of transplanted human endometrial cancer cells in nude mice[J];癌癥;2011年06期

7 王巍;史惠蓉;;RNA干擾技術在宮頸癌治療中的研究進展[J];國際婦產(chǎn)科學雜志;2008年01期

本文編號：2733311