發(fā)布時間：2020-06-28 12:41

【摘要】：目的:探討蟲草素(Cordycepin,Cord)對胃癌MGC-803細胞生物學行為的影響及其分子機制。方法:采用MTT法檢測不同濃度蟲草素對人正常胃黏膜上皮GES-1細胞和胃癌MGC-803細胞增殖活力的影響;平板克隆實驗檢測細胞集落形成能力;Hoechst 33342染色觀察細胞中凋亡小體的形成;Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡;PI單染流式細胞術檢測細胞周期;細胞劃痕實驗與Transwell小室遷移實驗檢測MGC-803細胞橫向和縱向遷移能力;Western blot實驗檢測細胞凋亡、周期、EMT等相關標志物,及Akt信號通路與MAPK信號通路相關蛋白的表達。通過RT-PCR與Western blot驗證GES-1與胃癌細胞株MGC-803、SG C-7901、HGC-27中C型凝集素樣受體2(CLEC2)基因的表達水平及蟲草素處理后MGC-803細胞中CLEC2基因的表達水平;通過siRNA轉染技術沉默CLE C2基因,并通過Western blot驗證轉染效果;MTT法和細胞劃痕實驗觀察CLE C2基因沉默對MGC-803細胞增殖及遷移能力的影響;Western blot實驗檢測C LEC2基因沉默對Akt信號通路蛋白的影響。結果:1.MTT實驗結果顯示,蟲草素對GES-1細胞的抑制作用遠弱于MGC-803細胞,且與對照組相比,不同濃度(25μM、25μM、100μM)的蟲草素作用于MGC-803細胞24h、48h、72h,均可顯著抑制細胞活力(P0.01);2.平板克隆實驗結果顯示,與對照組相比,用藥組細胞的集落形成能力均顯著下降(P0.01);3.Hoechst33342染色發(fā)現(xiàn),與對照組相比,用藥組細胞中凋亡小體隨藥物濃度的增加逐漸增多;4.Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術結果顯示,與對照組相比,50μM和100μM組細胞凋亡率顯著增高(P0.05或P0.01);5.PI單染流式細胞術檢測結果顯示,與對照組相比,用藥組細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯(P0.05或P0.01);6.細胞劃痕實驗與Transwell小室遷移實驗結果顯示,用藥組細胞的橫向與縱向遷移能力均顯著降低(P0.01);7.Western blot實驗結果顯示,蟲草素能夠上調凋亡相關蛋白cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9、凋亡底物cleaved-PARP、上皮細胞標志物E-cadherin、MAPK信號通路中p-JNK與p-P38的表達水平(P0.05或P0.01);下調凋亡抑制蛋白survivin、細胞周期期相關蛋白CDK1、CyclinBl、CDC25C、間質細胞標志物Vimentin、Snail、Slug、基質金屬蛋白酶家族成員MMP2和MMP9、Akt信號通路中p-Akt與p-4EBP1 的表達水平(P0.05 或P0.01);8.RT-PCR 與 Western blot 結果顯示,MGC-803、SGC-7901、HGC-27細胞中CLEC2的mRNA與蛋白表達水平均明顯低于GES-1細胞;9.RT-PCR與Western blot結果顯示,CLEC2的mRNA與蛋白的表達水平隨著蟲草素藥物濃度的增加而呈上升趨勢;10.CLEC2基因沉默后減弱蟲草素對胃癌細胞的抗增殖及抑制遷移的作用(P0.01);Western blot結果顯示,CLEC2基因沉默后上調Akt蛋白的磷酸化水平(P0.05)。結論:1.蟲草素抑制胃癌MGC-803細胞的增殖與遷移,其機制與下調Akt信號通路相關;2.蟲草素阻滯MGC-803細胞于G2/M期,其機制與上調JNK和P38的磷酸化水平相關;3.蟲草素通過上調CLEC2調控Akt信號通路抑制胃癌細胞增殖及遷移。
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

圖２．蟲草素誘導ＭＧＣ－８０３細胞凋亡逡逑Ａ．蟲草素處理ＭＧＣ－８０３細胞２４后用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色檢測細胞凋亡（白色箭頭所指），逡逑ｘ２００；邋Ｂ．蟲草素處理ＭＧＣＣ－８０３細胞４８ｈ后用流式細胞術檢測ＭＧＣ－８０３細胞凋亡率（＊：戶逡逑＜０．０５，邋＊＊：尸＜０．０１，ｎ＝３）邋；邋Ｃ．蟲草素處理ＭＧＣ－８０３細胞２４ｈ后Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實驗檢測細胞逡逑調亡相關蛋白邋Ｃｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ３、Ｃｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ９、Ｃｌｅａｖｅｄ－ＰＡＲＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ邋的表達水平（＊：逡逑尸＜０．０５；＊＊：尸＜０．０１，ｎ＝３）邋？逡逑２９逡逑

圖５．蟲草素調控Ａｋｔ信號通路與ＭＡＰＫ信號通路逡逑八，８．蟲草素處理＼１0（：－８０３細胞２４１１后認＾６１１＾１0１實驗檢測八１？信號通路中。－八１？、八１？、逡逑Ｐ－４ＥＢＰ１、４ＥＢＰ１邋和邋ＭＡＰＫ邋信號通路中邋ｐ－ＪＮＫ、ＪＮＫ、ｐ－Ｐ３８、Ｐ３８邋蛋白的表達（＊：尸＜０．０５，逡逑＊＊：尸＜０．０１，ｎ＝３）。逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2733026