【摘要】：目的:探討蟲草素(Cordycepin,Cord)對胃癌MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制。方法:采用MTT法檢測不同濃度蟲草素對人正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞和胃癌MGC-803細(xì)胞增殖活力的影響;平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞集落形成能力;Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞中凋亡小體的形成;Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測MGC-803細(xì)胞橫向和縱向遷移能力;Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡、周期、EMT等相關(guān)標(biāo)志物,及Akt信號通路與MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。通過RT-PCR與Western blot驗(yàn)證GES-1與胃癌細(xì)胞株MGC-803、SG C-7901、HGC-27中C型凝集素樣受體2(CLEC2)基因的表達(dá)水平及蟲草素處理后MGC-803細(xì)胞中CLEC2基因的表達(dá)水平;通過siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默CLE C2基因,并通過Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果;MTT法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察CLE C2基因沉默對MGC-803細(xì)胞增殖及遷移能力的影響;Western blot實(shí)驗(yàn)檢測C LEC2基因沉默對Akt信號通路蛋白的影響。結(jié)果:1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蟲草素對GES-1細(xì)胞的抑制作用遠(yuǎn)弱于MGC-803細(xì)胞,且與對照組相比,不同濃度(25μM、25μM、100μM)的蟲草素作用于MGC-803細(xì)胞24h、48h、72h,均可顯著抑制細(xì)胞活力(P0.01);2.平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,用藥組細(xì)胞的集落形成能力均顯著下降(P0.01);3.Hoechst33342染色發(fā)現(xiàn),與對照組相比,用藥組細(xì)胞中凋亡小體隨藥物濃度的增加逐漸增多;4.Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對照組相比,50μM和100μM組細(xì)胞凋亡率顯著增高(P0.05或P0.01);5.PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,用藥組細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯(P0.05或P0.01);6.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用藥組細(xì)胞的橫向與縱向遷移能力均顯著降低(P0.01);7.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,蟲草素能夠上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9、凋亡底物cleaved-PARP、上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、MAPK信號通路中p-JNK與p-P38的表達(dá)水平(P0.05或P0.01);下調(diào)凋亡抑制蛋白survivin、細(xì)胞周期期相關(guān)蛋白CDK1、CyclinBl、CDC25C、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、Snail、Slug、基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員MMP2和MMP9、Akt信號通路中p-Akt與p-4EBP1 的表達(dá)水平(P0.05 或P0.01);8.RT-PCR 與 Western blot 結(jié)果顯示,MGC-803、SGC-7901、HGC-27細(xì)胞中CLEC2的mRNA與蛋白表達(dá)水平均明顯低于GES-1細(xì)胞;9.RT-PCR與Western blot結(jié)果顯示,CLEC2的mRNA與蛋白的表達(dá)水平隨著蟲草素藥物濃度的增加而呈上升趨勢;10.CLEC2基因沉默后減弱蟲草素對胃癌細(xì)胞的抗增殖及抑制遷移的作用(P0.01);Western blot結(jié)果顯示,CLEC2基因沉默后上調(diào)Akt蛋白的磷酸化水平(P0.05)。結(jié)論:1.蟲草素抑制胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖與遷移,其機(jī)制與下調(diào)Akt信號通路相關(guān);2.蟲草素阻滯MGC-803細(xì)胞于G2/M期,其機(jī)制與上調(diào)JNK和P38的磷酸化水平相關(guān);3.蟲草素通過上調(diào)CLEC2調(diào)控Akt信號通路抑制胃癌細(xì)胞增殖及遷移。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

圖２．蟲草素誘導(dǎo)ＭＧＣ－８０３細(xì)胞凋亡逡逑Ａ．蟲草素處理ＭＧＣ－８０３細(xì)胞２４后用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色檢測細(xì)胞凋亡（白色箭頭所指），逡逑ｘ２００；邋Ｂ．蟲草素處理ＭＧＣＣ－８０３細(xì)胞４８ｈ后用流式細(xì)胞術(shù)檢測ＭＧＣ－８０３細(xì)胞凋亡率（＊：戶逡逑＜０．０５，邋＊＊：尸＜０．０１，ｎ＝３）邋；邋Ｃ．蟲草素處理ＭＧＣ－８０３細(xì)胞２４ｈ后Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞逡逑調(diào)亡相關(guān)蛋白邋Ｃｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ３、Ｃｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ９、Ｃｌｅａｖｅｄ－ＰＡＲＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ邋的表達(dá)水平（＊：逡逑尸＜０．０５；＊＊：尸＜０．０１，ｎ＝３）邋？逡逑２９逡逑

圖５．蟲草素調(diào)控Ａｋｔ信號通路與ＭＡＰＫ信號通路逡逑八，８．蟲草素處理＼１0（：－８０３細(xì)胞２４１１后認(rèn)＾６１１＾１0１實(shí)驗(yàn)檢測八１？信號通路中。－八１？、八１？、逡逑Ｐ－４ＥＢＰ１、４ＥＢＰ１邋和邋ＭＡＰＫ邋信號通路中邋ｐ－ＪＮＫ、ＪＮＫ、ｐ－Ｐ３８、Ｐ３８邋蛋白的表達(dá)（＊：尸＜０．０５，逡逑＊＊：尸＜０．０１，ｎ＝３）。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2733026