【摘要】：目的:基因芯片檢測研究發(fā)現(xiàn),hsa-mir-18b在正常腎組織與癌組織之間表達存在差異。對于雄激素受體(androgen receptor,AR)在腎癌中的表達及對腎癌發(fā)生發(fā)展的作用也有待商榷。本項目利用臨床腎癌組織標本及腎癌細胞系,檢測hsa-mir-18b及AR的表達,探討二者在腎癌增殖中的作用及關系,進一步明確兩者在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為探索腎細胞癌新的可行的治療方法及潛在的靶點提供實驗理論依據(jù)。方法:選擇腎小管上皮細胞系HKC,腎癌細胞系OSRC-2與ACHN,通過蛋白印跡實驗(Western blot)檢測細胞系中AR的表達,選擇AR表達較高的OSRC-2細胞系,采用慢病毒感染進行AR敲低。構(gòu)建四質(zhì)粒系統(tǒng)慢病毒載體,將慢病毒首先轉(zhuǎn)染于293T細胞,培養(yǎng)一定時間后收集病毒液。再將病毒液感染腎癌細胞系后繼續(xù)培養(yǎng)一定時間,之后用嘌呤霉素進行篩選,來獲得AR降表達的穩(wěn)定細胞系。采用噻唑藍比色法(MTT)檢測細胞的增殖能力。根據(jù)miRwalk網(wǎng)站預測的AR下游的靶microRNA,且根據(jù)參考文獻中基因芯片篩選出腎癌與腎組織中有差異表達的microRNA,選擇hsa-mir-18b進行研究。探討AR與hsa-mir-18b表達的關系,檢測二者對腎癌細胞增殖的作用。收集腎透明細胞癌(clear cell carcinoma renal cell carcinoma,ccRCC)配對的癌組織及鄰近正常組織30例。采用Western blot及Real-time PCR檢測AR在腎癌及鄰近正常組織中的表達。同時,用Real-time PCR檢測hsa-mir-18b的表達,驗證兩者之間的關系。結(jié)果:1.應用Western blot檢測OSRC-2、ACHN及HKC三個細胞系中的AR的蛋白表達水平,結(jié)果顯示OSRC-2細胞系中的AR的表達量較高,HKC及ACHN細胞系中不表達AR;Real-time PCR檢測AR的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果與蛋白水平一致。2.慢病毒轉(zhuǎn)染OSRC-2細胞系后,Western blot及Real-time PCR驗證顯示AR的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低,細胞系構(gòu)建成功。3.MTT實驗方法檢測顯示OSRC-2-shAR細胞增殖能力較對照組相比明顯降低(P0.01)。4.利用miRwalk網(wǎng)站預測AR可能參與調(diào)控的micro-RNA,7個數(shù)據(jù)庫進行預測,其中5個數(shù)據(jù)庫預測hsa-mir-18b可能為AR的靶microRNA。5.通過Real-time PCR檢測OSRC-2和OSRC-2-shAR細胞系中hsa-mir-18b的表達量,發(fā)現(xiàn)敲低AR后hsa-mir-18b的表達量升高(P0.001)。6.MTT實驗檢測OSRC-2+hsa-mir-18b inhibitor、OSRC-2、OSRC-2-shAR+hsa-mir-18b inhibitor和OSRC-2-shAR四種細胞系中腎癌細胞增殖能力,結(jié)果顯示AR通過調(diào)控hsa-mir-18b參與調(diào)節(jié)腎癌細胞的增殖。7.檢測腎癌組織樣本及鄰近正常腎組織中hsa-mir-18b的表達量,發(fā)現(xiàn)hsa-mir-18b在腎癌組織中較低,而相應的鄰近正常腎組織表達較高,其中26對(86.7%)hsa-mir-18b表達下調(diào),4對(13.3%)表達上調(diào)(P0.01)。8.hsa-mir-18b的表達水平與腎癌TNM分期顯著相關,但與患者的性別、年齡、腫瘤位置及大小、Furhman分級等因素無關。9.Western blot實驗檢測30對臨床標本中AR的蛋白表達情況,發(fā)現(xiàn)AR在腎癌組織中的表達比相應的鄰近正常腎組織明顯降低(P0.01)。Real-time PCR方法測驗30例配對組織中AR在mRNA水平的表達量,發(fā)現(xiàn)癌組織中AR的表達明顯升高(P0.01)。結(jié)論:1.在腎癌組織中AR的蛋白與mRNA的表達水平不一致。2.腎癌組織中hsa-mir-18b的表達較鄰近正常腎組織中降低。3.相關的功能研究顯示腎癌細胞系中,AR降表達后腎癌細胞的增殖能力降低,hsa-mir-18b表達增高;抑制hsa-mir-18b表達,腎癌細胞增殖能力增強。4.AR通過調(diào)控hsa-mir-18b參與調(diào)節(jié)腎細胞癌的增殖。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.11
【圖文】：

現(xiàn)結(jié)晶全部溶解；7)用酶標免疫檢測儀在570nm處測吸光度，計算每個孔的值并求平均值，每天重復計數(shù)，連續(xù)3或6天。1.1.4 統(tǒng)計學處理采用 SPSS20.0 統(tǒng)計軟件對本研究所有數(shù)據(jù)進行分析，應用配對 t 檢驗及卡方檢驗，其中 P<0.05 代表差異有統(tǒng)計學的意義。1.2 結(jié)果1.2.1 腎小管上皮細胞及腎癌細胞系 AR 的表達為了選擇 AR 表達較高的腎細胞系，我們采用免疫印跡 Western blot 實驗方法對腎小管上皮細胞 HKC 及腎癌 OSRC-2、ACHN 細胞系中 AR 的表達情況進行檢測。結(jié)果顯示 AR 在 OSRC-2 細胞系中表達較高，在人正常腎小管上皮細胞及 ACHN 細胞中不表達(圖 1.1 A)。同時為了判斷 AR 在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況，我們通過 Real-time PCR 對以上三種細胞系進行檢測，結(jié)果與蛋白表達水平一致(圖 1.1 B)。

Western blot及Real-time PCR實驗對敲低效果進行檢驗。其中，導入AR敲低質(zhì)粒組與未處理的OSRC-2細胞系相比，AR的表達明顯降低；導入空質(zhì)粒scramble(scr)組與未處理的OSRC-2細胞系相比，AR的表達無明顯差異(圖1.2)。這提示AR降表達的穩(wěn)定細胞系構(gòu)建成功，能夠用來進行下一步實驗。圖 1.2 慢病毒轉(zhuǎn)染后 AR 敲低效果左圖為利用 Western blot 檢測 AR 在細胞系中蛋白水平的表達，以 GAPDH當作內(nèi)參；OSRC-2 表示未經(jīng)處理的腎癌細胞，OSRC-2-scr 表示轉(zhuǎn)入無序質(zhì)粒的腎癌細胞，sh-AR 表示轉(zhuǎn)入 AR 降表達質(zhì)粒的腎癌細胞。右圖為利用 Real-timePCR 方法檢測轉(zhuǎn)染后細胞系中 AR 的 mRNA 表達水平，以 GAPDH 作為內(nèi)參，**代表 P<0.01。1.2.3 AR 降表達后細胞增殖能力降低通過體外 MTT 細胞增殖實驗的方法檢測 AR 對腎癌細胞增殖的影響。其中，未處理的 OSRC-2 實驗組與轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的對照組對比

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本文編號：2732530