【摘要】：目的:選取合適的人前列腺癌細(xì)胞系建立體外失巢凋亡耐受細(xì)胞模型,探究CEMIP對(duì)前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡、錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)、遷移及侵襲能力的影響。方法:用超低粘附細(xì)胞培養(yǎng)板(ULAP)懸浮培養(yǎng)人前列腺癌PC-3、DU145、C4-2、LNCa P細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。Transwell小室法檢測(cè)PC-3、DU145、C4-2、LNCa P細(xì)胞遷移及侵襲能力。用PC-3和DU145兩種細(xì)胞系建立失巢凋亡耐受模型,通過(guò)sh RNA沉默CEMIP的表達(dá),CCK-8法檢測(cè)親本細(xì)胞、失巢凋亡耐受細(xì)胞及沉默CEMIP細(xì)胞在ULAP中存活及增殖能力。采用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)沉默CEMIP對(duì)失巢凋亡耐受細(xì)胞抗凋亡能力的影響。軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默CEMIP對(duì)失巢凋亡耐受細(xì)胞錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)能力的影響。Western blotting法檢測(cè)親本細(xì)胞、失巢凋亡耐受細(xì)胞及沉默CEMIP細(xì)胞裂解的CEMIP、PARP和caspase-3蛋白表達(dá)量。采用Transwell小室法檢測(cè)沉默CEMIP對(duì)失巢凋亡耐受細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果:通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)PC-3、DU145、C4-2、LNCa P四種細(xì)胞系的檢測(cè)表明,PC-3和DU145有一定的失巢凋亡耐受能力,C4-2和LNCa P在懸浮培養(yǎng)條件下凋亡率較高。Transwell小室法表明PC-3和DU145細(xì)胞遷移、侵襲能力要高于C4-2和LNCa P;CCK8法表明在懸浮培養(yǎng)條件下失巢凋亡耐受細(xì)胞的細(xì)胞增殖率顯著高于對(duì)應(yīng)親本細(xì)胞或沉默CEMIP的細(xì)胞;流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)在懸浮培養(yǎng)條件下表明失巢凋亡耐受細(xì)胞的凋亡率顯著低于對(duì)應(yīng)親本細(xì)胞或沉默CEMIP的細(xì)胞。軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)表明沉默CEMIP可顯著抑制失巢凋亡耐受細(xì)胞的克隆形成率。Western blotting結(jié)果表明,失巢凋亡耐受細(xì)胞的CEMIP表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的親本細(xì)胞,構(gòu)建的sh RNA可顯著沉默其表達(dá)水平。CEMIP高表達(dá)可抑制激活型PARP和激活型Caspase-3蛋白表達(dá)。Transwell小室法表明沉默CEMIP可抑制失巢凋亡耐受細(xì)胞的遷移、侵襲能力。結(jié)論:PC-3和DU145細(xì)胞適合建立失巢凋亡耐受的細(xì)胞模型,CEMIP可抑制細(xì)胞失巢凋亡、促進(jìn)錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。目的:研究細(xì)胞脫離胞外基質(zhì)狀態(tài)下CEMIP對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響。方法:利用sh RNA沉默失巢凋亡耐受細(xì)胞CEMIP的表達(dá),用超低粘附培養(yǎng)板懸浮培養(yǎng)細(xì)胞一定時(shí)間,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn):1、利用熒光探針DCFH-DA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,通過(guò)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞ROS水平;2、使用Mito SOXTM紅色試劑染色,熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體超氧化物水平;3、單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷水平;4、JC-1熒光探針檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位;5、GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG水平;6、利用CCK8法檢測(cè)促氧化劑及抗氧化劑對(duì)細(xì)胞存活的影響;7、利用谷氨酰胺檢測(cè)試劑盒測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度。另外,分別用含谷氨酰胺培養(yǎng)基和不含谷氨酰胺培養(yǎng)基培養(yǎng)失巢凋亡耐受細(xì)胞及CEMIP沉默的細(xì)胞,CCK8法檢測(cè)谷氨酰胺對(duì)細(xì)胞存活的影響,GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG水平變化。結(jié)果:沉默失巢凋亡耐受細(xì)胞的CEMIP表達(dá)后,在懸浮培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增高,線粒體超氧化物水平增高,DNA損傷程度明顯增高,線粒體膜電位下降,GSH/GSSG比率降低。促氧化劑能進(jìn)一步降低CEMIP沉默后細(xì)胞存活率,而抗氧化劑能逆轉(zhuǎn)CEMIP沉默后細(xì)胞存活率的下降水平。沉默CEMIP表達(dá)后,失巢凋亡耐受細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中谷氨酰胺的消耗水平降低。谷氨酰胺剝奪條件下懸浮培養(yǎng)失巢凋亡耐受細(xì)胞可導(dǎo)致存活率下降,GSH/GSSG比率降低。結(jié)論:CEMIP可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞谷氨酰胺的攝取從而降低細(xì)胞“失巢”狀態(tài)下氧化應(yīng)激水平,促進(jìn)細(xì)胞的存活。目的:研究CEMIP影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡耐受的分子機(jī)制方法:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)沉默CEMIP后失巢凋亡耐受的前列腺癌細(xì)胞谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC1A5、SLC7A5、SLC38A3、SLC38A5)表達(dá)量變化。采用western blotting的方法進(jìn)一步證實(shí)SLC1A5蛋白量表達(dá)的變化。利用人前列腺癌組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,研究SLC1A5蛋白在正常組織與前列腺癌組織中表達(dá)量的變化。通過(guò)Oncomine和The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SLC1A5在前列腺癌及癌旁組織中表達(dá)水平差異進(jìn)行研究,對(duì)SLC1A5對(duì)前列腺癌生存與后進(jìn)行研究。采用western blotting法檢測(cè)ERK、p-ERK、c-MYC蛋白的表達(dá)差異。沉默CEMIP表達(dá)后再進(jìn)行SLC1A5過(guò)表達(dá)功能實(shí)驗(yàn),western blotting檢測(cè)細(xì)胞SLC1A5蛋白表達(dá)改變,GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG水平。結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光定量PCR和western blotting的方法檢測(cè)證實(shí)沉默CEMIP后SLC1A5的m RNA和蛋白表達(dá)量均顯著降低。組織芯片結(jié)果表明前列腺癌組織中SLC1A5的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。沉默CEMIP后失巢凋亡耐受的前列腺癌細(xì)胞中p-ERK、c-MYC蛋白的表達(dá)水平降低。沉默CEMIP表達(dá)后再進(jìn)行SLC1A5過(guò)表達(dá),結(jié)果表明GSH/GSSG降低的情況可被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:CEMIP通過(guò)調(diào)控ERK/c-MYC/SLC1A5通路影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn),從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞失巢凋亡耐受。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2732260