【摘要】：目的:乳腺癌是女性常見惡性腫瘤,近年來發(fā)病率呈上升趨勢,現(xiàn)已居女性惡性腫瘤首位。目前乳腺癌的治療以手術切除為主,但是目前腫瘤的局部擴散、淋巴結轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移仍然是制約乳腺癌預后的主要原因,尤其是三陰性乳腺癌缺乏特異的靶點,對內(nèi)分泌治療不敏感,治療效果差,復發(fā)率、死亡率居高不下。乳腺癌嚴重危害女性的生命健康和生活質(zhì)量,深入研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,尋找新的治療靶點,是有效提高乳腺癌患者生存率的重要方法。Nek家族又稱為“第三蛋白激酶家族”,參與細胞周期關鍵點調(diào)控,促進中心粒成熟,調(diào)節(jié)染色體凝聚、紡錘體組裝。人類Nek激酶家族包含11個成員(Nek1-Nek11),目前為止,Nek基因家族成員的大部分功能是未知的。近年來發(fā)現(xiàn)多個Nek家族成員在有絲分裂中參加G2-M檢驗點的調(diào)控。這其中又以Nek2與NIMA同源性最高,功能研究較為清楚。該基因參與調(diào)控中心體組裝以及染色體分離。Nek9的研究僅限于對細胞周期的調(diào)控。我們課題組前期發(fā)現(xiàn)乳腺癌中存在Nek9等位基因的雜合缺失,我們在此基礎上檢測了 316例乳腺癌中NEK9的表達,發(fā)現(xiàn)在乳腺浸潤性導管癌中,NEK9表達存在顯著下調(diào),甚至缺失,其表達與ER、PR表達呈正相關,與腫瘤大小、p53功能失常、HER-2擴增、高增殖指數(shù)、組織學級別呈負相關,提示NEK9低表達乳腺癌惡性程度高、生長快,Nek9或在乳腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。目前Nek9在在乳腺癌中如何發(fā)揮抑癌作用的機制尚未明確,為了更好的了解Nek9在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的機制,為臨床疾病診斷提供新的標記物及治療靶點,我們繼續(xù)探究Nek9在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。方法:1.利用細胞免疫組織化學、RT-qPCR及Western blot(WB)技術在mRNA及蛋白水平檢測乳腺癌細胞系中Nek9的基礎表達,根據(jù)表達量及細胞狀態(tài)選擇Nek9低表達的MDA-MB-468及Nek9高表達的MCF-7細胞系。2.構建針對Nek9的過表達及沉默病毒,對選定的細胞系進行感染,利用抗生素篩選,建立穩(wěn)定表達細胞株。選取MCF-7細胞系,Nek9沉默組作為實驗組,空載病毒轉(zhuǎn)染組作為對照,RT-qPCR、Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率,達到60%以上后,收細胞沉渣加Trizol送公司進行表達譜芯片檢測。3.利用免疫共沉淀結合蛋白質(zhì)譜技術,檢測與Nek9相互作用的蛋白。同時構建小鼠荷瘤模型進行體內(nèi)實驗,對Nek9抑制增及通路機制進行體內(nèi)實驗驗證。4.表達譜芯片及蛋白質(zhì)譜分析篩選出VEGF及PLK1細胞周期調(diào)控通路,利用RT-Qpcr、WB驗證檢測結果,并檢測通路相關蛋白變化。5.對芯片結果進行GO富集、KEGG分析,選出差異明顯的基因進行通路驗證。利用雙熒光素酶實驗尋找Nek9上游啟動子,免疫共沉淀驗證相互作用蛋白。6.利用免疫組化方法檢測CD34及VEGF表達,用以評估腫瘤血管生成情況。7.由于Nek9與細胞周期調(diào)控相關,選取MCF-7細胞,對細胞進行Nek9小干擾沉默處理,用諾考達唑?qū)⒓毎铚贕2/M期,去除藥物作用后,細胞生長一段時間,分別用α2和γ-tublin對紡錘體及中心粒染色,在共聚焦顯微鏡下觀察Nek9沉默組及空白對照組中心粒、紡錘體的狀態(tài)。結果:1.小鼠皮下成瘤實驗,兩組小鼠均成瘤,數(shù)量無明顯差異,但Nek9過表達組腫瘤體積明顯小于空白對照組腫瘤體積,且差異有統(tǒng)計學意義,在體內(nèi)Nek9抑制腫瘤的增殖。小鼠尾靜脈注射實驗,Nek9過表達組肝臟、肺臟等器官轉(zhuǎn)移較空白對照組少,進一步證實Nek9可以抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。2.表達譜芯片顯示Nek9沉默組VEGF通路基因存在較多改變,結合蛋白質(zhì)譜結果顯示Nek9與細胞周期調(diào)節(jié)相關。3.對VEGF通路關鍵蛋白進行驗證,結果顯示在Nek9沉默組,通路關鍵蛋白P38、HSP27、MAPK較空白組表達升高。表明,Nek9高達表可以抑制VEGF通路活性,從而起到抑制腫瘤血管生成的作用,抑制腫瘤增殖。對小鼠腫瘤組織進行免疫組織化學檢測CD34的表達以評估血管密度,統(tǒng)計結果顯示在Nek9過表達組CD34呈現(xiàn)高表達,這表明,在體內(nèi)Nek9抑制腫瘤組織血管生成。4.結合免疫共沉淀及蛋白質(zhì)譜結果分析,Nek6/7,、PLK、CDK1與Nek9存在相互作用,PLK激活磷酸化Nek9,進而磷酸化下游底物Nek6/7,共同發(fā)揮細胞周期調(diào)控作用。5.共聚焦顯微鏡下觀察到,Nek9沉默后,中心粒紡錘體形成異常,染色體不能正常分離。結論:1.在體內(nèi)Nek9抑制腫乳腺癌瘤細胞增殖,侵襲及轉(zhuǎn)移。2.Nek9通過抑制VEGF表達,抑制乳腺癌腫瘤血管生成,從而抑制乳腺癌增殖、侵襲及浸潤。3.Nek9被PLK1激活后,磷酸化Nek6/7,共同發(fā)揮細胞周期調(diào)控作用。4.Nek9缺失導致紡錘體組裝異常,中心粒不能正常分離,導致染色質(zhì)不能正常分離。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

圖１：各細胞系中Ｎｅｋ９基礎表達量的檢測。ＡＢＣ：ＮＥＫ９在激素受體陰性逡逑的細胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３】、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８弱陽性表達，在激素受體陽性細胞系逡逑ＭＣＦ－７中高表達；Ｄ：在ｍＲＮＡ水平檢測Ｎｅｋ９在各細胞系表達，ＭＤＡ－ＭＢ－２３ＭＤＡ－ＭＢ－４６８低表達，ＭＣＦ－７中高表達；Ｅ：蛋白蛋白水平檢測各細胞系ＮＥＫ９蛋白表達，ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８低表達，ＭＣＦ－７中高表達。逡逑２．建立穩(wěn)定表達細胞株逡逑前期實驗顯示ＮＥＫ９在ＭＤＡ－ＭＢ－４６８呈低表達，在ＭＣＦ－７中呈較高水平逡逑表達，所以構建Ｎｅｋ９過表達病毒ＬＶ－ＧＦＰ－Ｎｅｋ９及沉默病毒ＬＶ－ＧＦＰ－ｓｉＮｅｋ９，逡逑分別對ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＣＦ－７進行過表達、沉默病毒感染，并檢測感染效率。逡逑病毒載體進行了綠色熒光ＧＦＰ標記，預實驗得出最佳轉(zhuǎn)染條件，當ＭＯＩ值等逡逑于１００時，熒光顯微鏡下觀察到熒光最多，表示此條件下病毒轉(zhuǎn)染效率最高。逡逑轉(zhuǎn)染４８ｈ后，細胞內(nèi)開始表達綠色熒光，在熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞熒

圖４：基因芯片檢測差異基因。Ａ：芯片結果顯示，Ｎｅｋ９沉默后，有６０４個基逡逑因上調(diào)，７４３個基因下調(diào)；Ｂ：芯片數(shù)據(jù)ＧＯ富集分析Ｃ：基因芯片結果通路分析逡逑結果；Ｄ：篩選出的邋ＭＡＤ、ＳＭＡＤ９、ＩＴＧＢ２、ＡＲＥＧ、ＤＵＳＰ、ＳＥＬＰ邋差異基因，逡逑ｍＲＮＡ水平對芯片結果進行驗證。逡逑４．體內(nèi)、體外實驗證實Ｎｅｋ９抑制細胞增值。逡逑體內(nèi)實驗證實Ｎｅｋ９抑制腫瘤細胞增值。前期實驗已經(jīng)證實Ｎｅｋ９在體外實逡逑驗抑制細胞增值，為了更好的模擬體內(nèi)真實環(huán)境，我們對Ｎｅｋ９的功能進行了逡逑體內(nèi)驗證。首先構建ＮＥＫ９過表達的病毒感染ＭＤＡ－ＭＢ－４６８，經(jīng)過嘌呤霉素篩逡逑選，建立穩(wěn)定表達的細胞株。分別將對照組和過表達組細胞擴增，保證其他條逡逑件相同情況下進行荷瘤小鼠模型構建，并每周觀察記錄小鼠腫瘤情況。基因表逡逑達譜芯片篩選出ＳＭＡＤ９變化較明顯，我們推測Ｎｅｋ９通過ＴＧＦ－邋Ｐ通路發(fā)揮抑逡逑制細胞增值作用。逡逑

【參考文獻】

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1 Steven A. Stacker;Marc G. Achen;;The VEGF signaling pathway in cancer: the road ahead[J];Chinese Journal of Cancer;2013年06期

本文編號：2730512