【摘要】：目的:肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,其中80%是非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC),晚期患者可出現(xiàn)全身性的轉(zhuǎn)移,五年生存率極低。而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要過程,是NSCLC發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的根源。研究表明腫瘤細(xì)胞在EMT過程中,大量轉(zhuǎn)錄因子向核內(nèi)聚集而促進(jìn)了EMT相關(guān)蛋白表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box,FOX)家族在調(diào)控EMT過程中發(fā)揮了重要作用,其中FOXM1介導(dǎo)了多種腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)程,然而其對(duì)NSCLC細(xì)胞EMT的調(diào)控作用,尤其是對(duì)E-cadherin編碼基因CDH1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用尚不明確。本文以FOXM1為研究對(duì)象,探討其在調(diào)控NSCLC細(xì)胞EMT過程中的機(jī)制及FOXM1特異性抑制劑硫鏈絲菌素對(duì)EMT的干預(yù)作用。方法:(1)通過FOXM1蛋白表達(dá)水平改變探討其調(diào)控NSCLC細(xì)胞EMT的作用:HE染色觀察過表達(dá)FOXM1后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定過表達(dá)、敲減FOXM1后細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化;Western-Blot分析過表達(dá)、敲減FOXM1對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響。(2)分子機(jī)制探討FOXM1對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控:雙熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FOXM1對(duì)CDH1啟動(dòng)子的調(diào)控;核轉(zhuǎn)錄因子免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Ch IP)驗(yàn)證FOXM1對(duì)CDH1基因啟動(dòng)子的結(jié)合;在過表達(dá)FOXM1細(xì)胞中敲減Snail,通過雙熒光素報(bào)告酶、免疫熒光整體揭示FOXM1對(duì)EMT標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。(3)FOXM1抑制劑硫鏈絲菌素體外抗NSCLC細(xì)胞EMT作用:MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定硫鏈絲菌素對(duì)NSCLC細(xì)胞活力的影響;克隆形成實(shí)驗(yàn)研究硫鏈絲菌素對(duì)NSCLC細(xì)胞克隆形成能力的影響;細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察硫鏈絲菌素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程的作用;細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定硫鏈絲菌素對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的作用;Western-Blot分析硫鏈絲菌素對(duì)NSCLC細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:(1)GSEA分析以及在NSCLC細(xì)胞中的EMT蛋白、FOXM1表達(dá)檢測(cè)表明,FOXM1與EMT具有一定的相關(guān)性;過表達(dá)FOXM1后的細(xì)胞呈現(xiàn)上皮-間質(zhì)中間形態(tài),而非完全的間質(zhì)化形態(tài);過表達(dá)FOXM1的A549細(xì)胞遷移能力和侵襲能力增強(qiáng);N-cadherin,Snail,Vimentin的蛋白表達(dá)水平升高,E-cadherin的表達(dá)水平降低。在H1975細(xì)胞中敲減FOXM1的表達(dá)抑制了細(xì)胞侵襲遷移能力,E-cadherin表達(dá)水平升高,N-cadherin,Snail,Vimentin表達(dá)水平降低。(2)雙熒光素報(bào)告酶實(shí)驗(yàn)表明FOXM1對(duì)于CDH1-2000-promoter熒光素報(bào)告載體具有抑制作用;Ch IP結(jié)果證實(shí)了FOXM1能夠內(nèi)源性結(jié)合于CDH1基因啟動(dòng)子;在過表達(dá)FOXM1的細(xì)胞中敲減Snail后,E-cadherin的表達(dá)恢復(fù)。(3)MTT結(jié)果顯示硫鏈絲菌素對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖具有抑制作用;克隆形成實(shí)驗(yàn)表明硫鏈絲菌素能抑制NSCLC細(xì)胞的克隆形成能力;TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程中伴隨著FOXM1的表達(dá)增加,細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)這一過程能被硫鏈絲菌素所逆轉(zhuǎn);細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明硫鏈絲菌素能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)而增強(qiáng)的細(xì)胞遷移和侵襲的作用,Western-Blot分析表明,硫鏈絲菌素能夠下調(diào)TGF-β1所誘導(dǎo)的FOXM1,N-cadherin,Snail,Vimentin表達(dá)升高,阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的E-cadherin表達(dá)降低。結(jié)論:過表達(dá)FOXM1能夠促進(jìn)NSCLC細(xì)胞EMT過程,而降低FOXM1的表達(dá)能夠抑制這一過程。FOXM1能夠抑制CDH1的轉(zhuǎn)錄,并能夠促進(jìn)Snail間接對(duì)CDH1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用來介導(dǎo)EMT過程。FOXM1抑制藥物硫鏈絲菌素對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖、克隆及EMT過程具有抑制作用。以上結(jié)果表明可以通過改變FOXM1的表達(dá)來干預(yù)EMT過程。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2
【圖文】：

圖 1. EMT 及其標(biāo)志物轉(zhuǎn)化Fig 1. EMT and switch its biomarkers (Scanlon et al, Journal of dental research, 2013).對(duì)于 EGFR、ALK 基因靶向藥物無法獲益的 NSCLC 患者，或?qū)ζ洚a(chǎn)生獲得耐藥的，極易發(fā)生 EMT 而出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究表明，EMT 也是介導(dǎo)腫瘤干胞特性獲得的重要來源，抗 EMT 策略配合靶向藥物的使用，往往能夠比單一使靶向藥物發(fā)揮更加期待的效果[8]。因此，探討 EMT 關(guān)鍵效應(yīng)分子，挖掘逆轉(zhuǎn) EM新機(jī)制，能夠?yàn)榻?NSCLC 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警和輔助靶向治療方案提供重要理論基礎(chǔ)。三、轉(zhuǎn)錄因子FOXM1 介導(dǎo)惡性腫瘤演變過程的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展不論是天然抗性還是獲得耐藥腫瘤細(xì)胞往往都存在著異常的轉(zhuǎn)錄特征，并參與腫瘤轉(zhuǎn)移多個(gè)生物學(xué)過程調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄基因都出現(xiàn)了表達(dá)改變的情況，其中重要的便是 EMT 上游的轉(zhuǎn)錄因子[9, 10]。因此，我們不能忽視轉(zhuǎn)錄因子在 NSCL發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

圖 2. FOXM1 參與了腫瘤發(fā)展的生物學(xué)過程及其表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)的 meta 分析Fig 2. FOXM1 participate in multiple biological process in tumor progression (Bella et al,Seminars in Cancer Biology, 2014) and its meta analysis of expression risk (Dai et al, DiseaseMarkers, 2015).四、異常表達(dá)FOXM1 是NSCLC 患者的重要風(fēng)險(xiǎn)因素在 NSCLC 的發(fā)生發(fā)展中，關(guān)鍵分子的出現(xiàn)對(duì)惡性復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的指示至關(guān)重要。FOXM1 的異常表達(dá)近年被不斷從腫瘤樣本中鑒定出來，由 Dai 等對(duì)該類研究進(jìn)行了大量收集并進(jìn)行 meta 分析[19]（圖 2 右），數(shù)據(jù)表明 FOXM1 可以作為判定

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

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本文編號(hào)：2728670