【摘要】：目的:乳腺癌是世界上女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。隨著研究的不斷深入,腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)理論為乳腺癌的治療提供了新的思路。CSCs是存在于腫瘤細(xì)胞中具有很強(qiáng)的自我更新能力、處于靜止期、高表達(dá)干性標(biāo)記物、抗凋亡、高表達(dá)耐藥蛋白、具有無限增殖及分化潛能的一小群特殊細(xì)胞。目前已在多種實(shí)體腫瘤如乳腺癌、大腸癌、肝癌、腦癌等癌癥中發(fā)現(xiàn)。靶向乳腺癌腫瘤干細(xì)胞(Breast cancer stem cells,BCSCs)對臨床設(shè)計(jì)更有效的合理化療方案具有重要意義。在實(shí)體瘤中,CSCs常常處于低氧微環(huán)境,低氧龕微環(huán)境往往誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor,HIFs)的積累。HIFs是由basic helix-loop-helix-Per-ARNT-Sim組成的轉(zhuǎn)錄因子,包含一個氧含量敏感的?亞單位異構(gòu)體(HIF-1?,HIF-2?,HIF-3?)與一個?亞單位配體(ARNT)。雖然HIF-1?與HIF-2?在結(jié)構(gòu)上高度同源,但生物學(xué)功能卻不完全相同。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤干細(xì)胞中,HIF-1?與HIF-2?參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞干性,尤其HIF-2?對CSCs干性的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注,但HIF-2?如何發(fā)揮功能介導(dǎo)干性及耐藥性仍未有相關(guān)報(bào)道。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細(xì)胞器病理過程,通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來完成。研究報(bào)道UPR通路的激活增強(qiáng)了多種腫瘤細(xì)胞的耐藥性。近年有研究報(bào)道,HIF-2?及UPR通路與腫瘤的發(fā)生及耐藥密切相關(guān)。但在乳腺癌干細(xì)胞中HIF-2?是否介導(dǎo)UPR通路調(diào)節(jié)對傳統(tǒng)化療藥的耐藥性仍未見報(bào)道。(-)-Epigallocatechin-3-gallate(EGCG)是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體,是茶多酚生物活性的主要成分,具有抗氧化、抗衰老等作用。大量研究發(fā)現(xiàn),在不同的腫瘤動物模型及細(xì)胞系中,EGCG做為抗氧化劑可通過調(diào)節(jié)HIF-1?與HIF-2?發(fā)揮抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、降低化療藥耐藥等作用。但是,EGCG是否通過調(diào)控HIF-2?調(diào)節(jié)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的耐藥性仍未見報(bào)道。Wnt、Notch信號通路是兩條高度保守與干細(xì)胞自我更新維持密切相關(guān)的通路。目前關(guān)于HIF-2?與Wnt/β-catenin、Notch通路相互作用,調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的報(bào)道不一致,其作用與BCSCs干性和藥物敏感性的關(guān)系也未見報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)通過無血清非粘附懸浮培養(yǎng)MCF-7和T47D乳腺癌細(xì)胞,富集具有BCSCs特性的乳腺癌球囊細(xì)胞MCF-7 MS和T47D MS,研究HIF-2?對乳腺癌干細(xì)胞干性及藥物敏感性的調(diào)控作用,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR通路和Wnt通路、Notch通路在HIF-2?調(diào)控乳腺癌細(xì)胞干性及藥物敏感性中的作用機(jī)制,為研究乳腺癌干細(xì)胞耐藥性形成與逆轉(zhuǎn)的新切入點(diǎn)提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:采用無血清非粘附懸浮培養(yǎng)MCF-7和T47D乳腺癌細(xì)胞,富集MCF-7MS和T47D MS乳腺癌球囊細(xì)胞;通過流式檢測干性標(biāo)志物CD44~+CD24~-細(xì)胞比例,Western blot檢測干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4及Nanog蛋白表達(dá)水平,軟瓊脂集落形成檢測自我更新能力,Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移侵襲能力,恢復(fù)血清培養(yǎng)觀察球囊細(xì)胞的再分化潛能,裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測在體致瘤性,對MCF-7 MS和T47D MS乳腺癌球囊細(xì)胞的自我更新、侵襲遷移、分化及致瘤性等干性進(jìn)行鑒定。慢病毒轉(zhuǎn)染及篩選構(gòu)建HIF-2α過表達(dá)的MCF-7和T47D穩(wěn)轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞株,及HIF-2α沉默的MCF-7 MS和T47D MS穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,分別通過qRT-PCR和Western blot檢測HIF-2α及下游靶基因HES-1、VEGFA表達(dá),驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。通過CCK-8assay檢測對紫杉醇(PTX)的藥物敏感性變化,考察干擾HIF-2α對乳腺癌干細(xì)胞藥物敏感性的影響;軟瓊脂集落形成檢測細(xì)胞克隆形成能力的變化,血清分化實(shí)驗(yàn)考察貼壁分化能力,Western blot檢測OCT4、Nanog、CK14的表達(dá)變化,考察HIF-2α對乳腺癌干細(xì)胞干性的影響。Western blot檢測沉默HIF-2α后MCF-7 MS和T47D MS細(xì)胞,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白GRP78、IRE1、PERK、XBP1s、p-IRE1、p-PERK的表達(dá)影響;耐藥蛋白P-GP的表達(dá)變化、LC-MS/MS檢測細(xì)胞內(nèi)PTX藥物蓄積,mitoSOX染色檢測細(xì)胞內(nèi)mtROS水平;qRT-PCR檢測SOD2的表達(dá)水平。探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在HIF-2α調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞干性及藥物敏感性中的作用。通過裸鼠皮下接種穩(wěn)轉(zhuǎn)HIF-2α沉默慢病毒的MCF-7 MS細(xì)胞,構(gòu)建HIF-2α沉默裸鼠移植瘤模型,考察HIF-2α沉默對裸鼠移植瘤生長及對PTX藥物敏感性的影響;通過免疫組織化學(xué)染色檢測瘤組織HIF-2α、GRP78、P-GP表達(dá);Western blot檢測瘤組織UPR通路相關(guān)蛋白表達(dá),LC-MS/MS檢測組織內(nèi)PTX藥物蓄積,在體考察HIF-2α對乳腺癌細(xì)胞干性和藥物敏感性的影響及與UPR通路的關(guān)系。EGCG聯(lián)合PTX處理MCF-7 MS細(xì)胞,MTT實(shí)驗(yàn)檢測對PTX藥物敏感性的變化。Western blot檢測HIF-2?、GRP78的表達(dá)。通過裸鼠皮下接種MCF-7 MS細(xì)胞,構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,同時給予EGCG和PTX腹腔注射給藥,考察EGCG聯(lián)合PTX對裸鼠移植瘤生長及對PTX藥物敏感性的影響。通過免疫組織化學(xué)染色檢測組織HIF-2α、GRP78表達(dá);在體考察EGCG對乳腺癌干細(xì)胞的藥物敏感性的影響及對HIF-2α的調(diào)控。MOE預(yù)測及OWLS體外親合力試驗(yàn),考察EGCG與HIF-2?的體外結(jié)合情況及具體的綁定位點(diǎn)。Western blot檢測過表達(dá)HIF-2α的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞Wnt、Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá);MTT實(shí)驗(yàn)檢測Wnt通路阻斷劑DKK-1、Notch通路阻斷劑L685,458處理對HIF-2α過表達(dá)的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞在PTX處理后細(xì)胞生存率的改變;通過流式檢測細(xì)胞凋亡率的改變,通過軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力的改變。通過Western blot檢測過表達(dá)HIF-2α后MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞并給與通路抑制劑DKK-1、L685,458后通路的Wnt、Notch通路蛋白的表達(dá)�？疾霩IF-2?是否通過調(diào)控Wnt,Notch通路調(diào)控乳腺癌MCF-7,MDA-MB-231細(xì)胞的耐藥性。結(jié)果:1.MCF-7和T47D乳腺癌細(xì)胞在無血清非粘附懸浮培養(yǎng)條件下可富集形成MCF-7 MS和T47D MS乳腺癌球囊細(xì)胞;與親本的MCF-7和T47D細(xì)胞比,MCF-7MS和T47D MS球囊細(xì)胞具有高比例的CD44~+CD24~-細(xì)胞,高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4和Nanog,具有強(qiáng)的形成單克隆細(xì)胞球的能力、遷移和侵襲能力、分化潛能及在體致瘤性。2.MCF-7 MS和T47D MS細(xì)胞對PTX耐藥,且高表達(dá)HIF-1α/HIF-2α,尤其是HIF-2α。慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA-HIF-2α質(zhì)粒,可沉默MCF-7 MS和T47D MS細(xì)胞HIF-2α的表達(dá),增加對PTX的敏感性,增加細(xì)胞內(nèi)PTX,且沉默HIF-2α可降低MCF-7 MS和T47D MS細(xì)胞克隆形成能力及干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4、Nanog的表達(dá);慢病毒轉(zhuǎn)染HIF-2α-cDNA質(zhì)粒,MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞過表達(dá)HIF-2α,降低對PTX的敏感性,且過表達(dá)HIF-2α可增強(qiáng)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力及干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4、Naong的表達(dá)。3.沉默HIF-2α明顯降低了MCF-7 MS和T47D MS細(xì)胞UPR通路相關(guān)蛋白及P-GP的表達(dá);降低了SOD2 mRNA的表達(dá)、mtROS表達(dá)增加;加入mtROS抑制劑mitoTEMPOL后HIF-2α沉默誘導(dǎo)的藥物敏感性增強(qiáng)被抑制,細(xì)胞內(nèi)mtROS水平下降且UPR通路的抑制得到逆轉(zhuǎn)。4.沉默HIF-2α的MCF-7 MS細(xì)胞荷瘤鼠瘤體積和瘤重均降低,且增強(qiáng)了荷瘤鼠對PTX的藥物敏感性;沉默HIF-2α的MCF-7 MS細(xì)胞荷瘤鼠瘤組織的HIF-2α和GRP78、UPR通路相關(guān)蛋白表達(dá)下降,P-GP蛋白表達(dá)降低,組織內(nèi)PTX積蓄增加。5.EGCG聯(lián)合PTX處理MCF-7 MS細(xì)胞,可增強(qiáng)MCF-7 MS細(xì)胞對PTX的藥物敏感性,抑制自我更新能力;并抑制HIF-2α及GRP78的表達(dá)。EGCG可以靶向結(jié)合HIF-2αPAS區(qū)域,抑制HIF-2α的轉(zhuǎn)錄活性。6.過表達(dá)HIF-2α的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞,Wnt通路和Notch通路蛋白表達(dá)均明顯增高;Wnt通路抑制劑DKK-1、Notch通路抑制劑L685,458逆轉(zhuǎn)了HIF-2α誘導(dǎo)的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞對PTX的耐藥;抑制Wnt、Notch通路活性后,過表達(dá)HIF-2α誘導(dǎo)的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞集落形成能力的增強(qiáng)被明顯抑制;凋亡細(xì)胞比例明顯增加。結(jié)論:1.通過無血清非粘附懸浮培養(yǎng)乳腺癌MCF-7和T47D乳腺癌細(xì)胞可成功富集具有強(qiáng)自我更新能力、侵襲遷移能力、分化潛能及在體致瘤性等乳腺癌干細(xì)胞特性的MCF-7 MS和T47D MS乳腺癌球囊細(xì)胞。2.沉默HIF-2α能抑制乳腺癌干細(xì)胞對PTX的耐藥性。3.HIF-2α通過調(diào)控mtROS介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR通路影響乳腺癌干細(xì)胞對PTX的耐藥性。4.EGCG通過靶向結(jié)合HIF-2αPAS區(qū)域,抑制HIF-2?轉(zhuǎn)錄活性,增強(qiáng)PTX對MCF-7 MS細(xì)胞的殺傷作用。5.HIF-2α通過激活Wnt、Notch通路增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞干性及對PTX的耐藥。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

圖 1 蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線 蛋白樣品處理：用 6×蛋白上樣緩沖液處理樣品，根據(jù)定量得的蛋白濃量 30 μl:50 μg 蛋白樣品，不足 30 μl 用 PBS 補(bǔ)齊，金屬浴 100 ℃ 10 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳：洗凈玻璃板，烘架上；配置 8 %、10 %、12 %分離膠和 5 %濃縮膠，分別先后灌注分，立即插入干凈的梳子，室溫聚合 15 min，待濃縮膠凝固，把膠架置加入 1×電泳緩沖液 500 mL，浸泡 20 min 后，上樣； 恒壓 60 V，至移至濃縮膠和分離膠的分界處，調(diào)節(jié)電壓至 100 V，待溴酚藍(lán)指示劑部 1 cm 處，停止電泳；將凝膠取出放入回收的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。 恒壓濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜：切膠，剪取相同大小的 0.45 μm/ 0.22 μm PVDF 膜30 s，轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡 5 min，將 PVDF 膜覆蓋于凝膠上相應(yīng)目標(biāo)位置與轉(zhuǎn)膜夾大小相同的濾紙，轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕，用玻璃棒趕盡氣泡；按海

14圖 1-1. MCF-7 MS 細(xì)胞干性鑒定(A)光學(xué)顯微鏡下 MCF-7 細(xì)胞與 MCF-7 MS 細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異；(B)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢MCF-7、MCF-7 MS 細(xì)胞自我更新能力；(C)流式檢測 MCF-7、MCF-7 MS 細(xì)胞干性標(biāo)記NANOG 的表達(dá)差異；(D)WB 檢測 MCF-7 、MCF-7 MS 細(xì)胞干性標(biāo)記物 OCT4 的表達(dá)(E)血清恢復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測 MCF-7 MS 細(xì)胞分化能力的恢復(fù)；* P<0.05，** P<0.01，*** P<0MCF-7 細(xì)胞相比。

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本文編號：2727830