【摘要】：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。成人總體發(fā)病率75.3/10萬人,死亡率53.4/10萬人,發(fā)病率和死亡率在成人所有惡性腫瘤中位居第13位及第9位。目前AML治療進展緩慢,盡管對AML的生物學(xué)特征的理解日漸深入,新的靶向治療藥物被研發(fā)使用,但總體生存率仍低。具有自我更新能力的白血病干細(xì)胞是白血病細(xì)胞惡性增殖的“罪魁禍?zhǔn)住?而這些細(xì)胞具有高增殖、低凋亡、分化阻滯、耐藥等特性,導(dǎo)致白血病病人在化療放療得到完全緩解后復(fù)發(fā)率仍非常高。AML發(fā)病機制復(fù)雜,異質(zhì)性極高,絕大部分類型治療效果差,預(yù)期生存期短。分子生物學(xué)特征是判斷AML預(yù)后的重要標(biāo)志之一。超過95%的AML病人至少攜帶1種體細(xì)胞突變。目前臨床常用預(yù)后相關(guān)基因仍然存在較大局限性。因此發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后因素,探索其功能,闡明在AML環(huán)境中的作用機制,在AML診斷及治療中具有重要意義。絡(luò)氨酸激酶受體ErbB2(v-erb-b2 avian erythroblast leukemia viral oncogene homolog 2)基因,也被稱為HER2(human epidermal growth factor receptor 2)作為一種癌基因已被廣泛研究和認(rèn)知。它通過激活經(jīng)典絡(luò)氨酸激酶下游分子如RAS、MAPK,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞有絲分裂增強,并由此導(dǎo)致多種腫瘤預(yù)后不良。2000年,Borg通過酵母雙雜交法發(fā)現(xiàn)了一個新的PDZ(PSD95/discs large/ZO-1)蛋白,它在上皮細(xì)胞中作為ErbB2的交互作用蛋白發(fā)揮作用,故將其命名為Erbin(ErbB2 interacting protein,也稱為Erbin)。Erbin屬于一種全新的PDZ蛋白家族,稱為LAP(leucine-rich repeat and PDZ domain)家族。Erbin的功能目前尚不十分清楚,其在大多數(shù)人組織中表達,在腦、心臟、腎臟、肌肉及胃組織中較為豐富,對維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、發(fā)育過程中器官形態(tài)的發(fā)生及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等具有重要作用。Erbin在實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的功能尚存在爭議,在急性髓系白血病中的功能及機制尚不明確。miRNAs是一種廣泛存在的對基因進行微調(diào)的分子,約占人類基因組總基因數(shù)的2%-3%。從結(jié)構(gòu)上來說,miRNAs是一類長度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA,約22nt,通過5’端6-8個序列(種子序列)與其靶基因的m RNA分子的3’端非編碼區(qū)域(3’UTR)互補配對在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負(fù)調(diào)控,一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因。miRNA可導(dǎo)致m RNA的降解或翻譯抑制,從而進一步調(diào)控多種生物學(xué)行為如發(fā)育的進程、干細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、疾病以及腫瘤發(fā)生等。既往研究表明,miR-183在腫瘤中通常呈高表達。miR-183在腫瘤細(xì)胞中高表達常伴隨等位基因失衡,染色體斷裂、復(fù)制數(shù)增加等,常表現(xiàn)為致癌作用。迄今為止,有關(guān)miR-183與Erbin在AML中的研究較少。本研究通過體外、體內(nèi)實驗及臨床驗證揭示了Erbin與AML發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,Erbin在AML可抑制細(xì)胞增殖,促進幼稚細(xì)胞分化成熟,起抑癌作用。并通過生物信息學(xué)預(yù)測,體外實驗驗證miR-183-5p對Erbin在AML中的調(diào)控,通過免疫熒光素酶報告基因及功能挽救實驗證實miR-183-5p對Erbin的直接靶向作用,表明miR-183-5p通過靶向Erbin調(diào)控AML的增殖、分化能力,miR-183-5p/Erbin通路是AML潛在的治療靶點。第一部分體外研究Erbin對AML細(xì)胞增殖、分化作用及信號通路的影響研究目的:通過體外實驗探索及分析Erbin對AML增殖及分化功能的影響及相關(guān)機制。研究方法:通過定量PCR和Western Blot檢測4種AML細(xì)胞株HL60、THP-1、SHI-1和U937中內(nèi)源性Erbin表達,并挑選出相對表達高及低的細(xì)胞各1株。轉(zhuǎn)染Erbin過表達質(zhì)粒慢病毒使其在低表達細(xì)胞株中過表達,轉(zhuǎn)染sh RNA慢病毒使Erbin在高表達細(xì)胞株中下調(diào)。用過CCK8及流式細(xì)胞術(shù)檢測上述兩種細(xì)胞和各自空載體對照組細(xì)胞周期、增殖、凋亡及分化情況,以及與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21Waf1/CIP1、p27Kip1表達的關(guān)系。結(jié)果:U937中Erbin相對表達量較高,HL60和SHI-1細(xì)胞中表達量較低,HL-60與SHI-1表達量無顯著性差異。過表達Erbin的HL60細(xì)胞48h細(xì)胞活性較對照組顯著降低,G2/M期細(xì)胞比例較對照組降低,凋亡率較對照組增高,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21Waf1/CIP1、p27Kip1表達升高,分化程度較對照組升高。下調(diào)Erbin的U937細(xì)胞48h細(xì)胞活性較對照組顯著增高,G2/M期細(xì)胞比例較對照組升高,p21Waf1/CIP1、p27Kip1表達減低,分化程度較對照組降。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:體外Erbin在AML細(xì)胞中通過抑制細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期,促進細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化來發(fā)揮抗腫瘤活性。第二部分體內(nèi)研究Erbin對AML增殖及分化的影響研究目的:體內(nèi)實驗驗證Erbin對AML增殖及分化功能的影響。研究方法:構(gòu)建裸鼠AML荷瘤及對照模型,對模型鑒定分析Erbin在體內(nèi)的作用。腫瘤組織行免疫組化,外周血鏡檢髓系白血病細(xì)胞浸潤程度,肝臟及脾臟行病理學(xué)活檢,流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓細(xì)胞CD33表達陽性率。結(jié)果:Erbin過表達HL-60組荷瘤小鼠較其對照組小鼠腫瘤體積小,免疫組化顯示p RAF、p ERK1/2、CD11b較對照組高表達,外周血涂片顯示髓系白血病細(xì)胞浸潤較對照組降低,骨髓細(xì)胞CD33陽性率較對照組降低,肝臟、脾臟HE染色光鏡下原始細(xì)胞比例無顯著差異;Erbin下調(diào)U937組荷瘤小鼠其對照組小鼠腫瘤體積大,免疫組化顯示p RAF、p ERK1/2、CD11b較對照組低表達,外周血涂片顯示髓系白血病細(xì)胞浸潤較對照組增加,骨髓細(xì)胞CD33表達較對照組升高,肝臟、脾臟HE染色光鏡下原始細(xì)胞比例無顯著差異。結(jié)論:Erbin在體內(nèi)可抑制AML細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化,與體外實驗的結(jié)果相符。第三部分hsa-miR-183-5p直接靶向作用Erbin調(diào)控AML細(xì)胞的增殖研究目的:探討miR-183-5p對Erbin的調(diào)控機制以及對AML細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。研究方法:通過生物信息學(xué)預(yù)測,定量PCR在AML細(xì)胞株HL60及937中篩選可能調(diào)控Erbin的miR。定量PCR及Western blot驗證目標(biāo)miR對Erbin的調(diào)控。CCK8及流式細(xì)胞術(shù)檢測目標(biāo)miR在HL60及937細(xì)胞中影響細(xì)胞周期、增殖、凋亡的情況,熒光素酶報告基因及功能挽救實驗驗證miR-183-5p與Erbin的直接結(jié)合作用。臨床樣本檢測miR-183-5p/Erbin的表達水平。結(jié)果:經(jīng)篩選miR-183-5p被認(rèn)為可能參與調(diào)控Erbin。經(jīng)PCR及Western blot驗證,miR-183-5p可在m RNA及蛋白水平調(diào)控Erbin的表達。miR-183-5p通過調(diào)控Erbin的表達調(diào)節(jié)RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT/Fox O3a通路的磷酸化水平,經(jīng)CCK8及流式細(xì)胞術(shù)檢測,miR-183-5p可調(diào)控HL-60/U937細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期。免疫熒光素酶報告基因及功能挽救實驗證實miR-183-5p與Erbin存在直接結(jié)合與調(diào)控。Erbin在AML患者體內(nèi)水平明顯低于健康對照組,pri-miR-183-5p及mature-miR-183-5p在AML患者體內(nèi)水平顯著高于正常對照組。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:miR-183-5p通過與Erbin直接結(jié)合調(diào)控AML的增殖
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.71

【參考文獻】

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1 Zengdi Zhang;Sanen Li;Steven Y Cheng;;The miR-183～96～182 cluster promotes tumorigenesis in a mouse model of medulloblastoma[J];The Journal of Biomedical Research;2013年06期

本文編號：2721758