【摘要】：第一部分:細胞周期蛋白CDCA5表達與肝細胞癌患者的臨床病理及預后的關系目的:肝癌患者的預后較差,對肝癌細胞周期的研究相對匱乏。在腫瘤細胞周期中,細胞分裂周期相關蛋白5(Cell division cycle associated 5,CDCA5)表達量增高,但其與肝細胞癌患者的臨床指標、病理特征及預后的關系仍無相關研究。本部分研究旨在探討CDCA5表達與肝細胞癌的臨床病理關系,及CDCA5與肝細胞癌行根治性切除術患者預后之間的關系。材料與方法:1.臨床病理資料:回顧性分析2009年9月至2012年9月原發(fā)性肝癌行根治性肝葉切除術患者的臨床病理資料。搜集患者臨床病理特征、手術后并發(fā)癥及無瘤生存時間、總生存時間。采用免疫組織化學方法檢測肝癌組織、癌旁組織、正常肝臟組織CDCA5表達。依據(jù)免疫組化檢查結果,將肝癌患者分為CDCA5高表達組、CDCA5低表達組,對比兩組患者的臨床、病理特征及預后之間的差異。分析患者術后嚴重并發(fā)癥(Clavien-Dindo分級Ⅲ-Ⅴ級)發(fā)生的危險因素。并分析CDCA5與患者預后的關系,影響患者無瘤生存時間和總生存時間的危險因素。2.免疫組織化學檢測CDCA5:CDCA5單克隆抗體購自Abcam公司;二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)濃縮型試劑盒,Goat anti-Rabbit Ig G購自Bioswamp公司。CDCA5單克隆抗體免疫組織化學染色具體實驗操作步驟按試劑盒說明書進行。主要染色步驟如下:石蠟切片脫蠟水化,3%H2O2孵育封閉內源性過氧化物酶,高壓抗原修復,正常山羊血清封閉,一抗(CDCA5單抗)4℃過夜,PBS沖洗3次,滴加二抗(山羊抗兔Ig G抗體-HRP),PBS沖洗3次。DAB顯色,蘇木素淡復染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片前采用二甲苯透明,然后顯微鏡下觀察。3.統(tǒng)計學方法:計量資料正態(tài)分布數(shù)據(jù)的表示采用`c±S,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的表示采用中位數(shù)(全距)。計量資料正態(tài)分布兩組間比較采用t檢驗,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。c2檢驗應用于兩組計數(shù)資料間的比較。分析CDCA5表達與患者臨床病理特征、無瘤生存時間、總生存時間的關系。Logistic回歸分析探討影響患者術后Clavien-Dindo分級Ⅲ-Ⅴ級并發(fā)癥發(fā)生和肝功能衰竭的危險因素。采用log-rank法進行單因素分析,對比組間患者生存時間的差異。多因素分析采用Cox回歸法,評價影響患者無瘤生存時間(Recurrence-free Survival,RFS)及總生存時間(Overall Survival,OS)的危險因素。結果:總178例患者納入本研究,取178例肝癌組織中CDCA5表達半定量評分的中位數(shù),作為CDCA5高表達與低表達的截點。CDCA5高表達患者89例,CDCA5低表達患者89例。兩組患者年齡、性別組成、Child-Pugh評分、ALT、ALB、TBIL、AFP、PLT、HBV-DNA、MELD評分對比,差異無統(tǒng)計學意義。CDCA5高表達組患者腫瘤直徑較大,微血管侵犯發(fā)生率較高。本研究納入患者術后并發(fā)癥發(fā)生率為37.6%(67例),術后并發(fā)癥包括:膽瘺、術后腹腔內出血、肝功能衰竭、胸/腹腔積液、呼吸衰竭、腎功能衰竭、腹腔膿腫、下肢深靜脈血栓形成、急性肺動脈栓塞、心功能衰竭、切口并發(fā)癥等。術后肝功能衰竭總發(fā)生率4.5%(8例)。術后30天死亡率為2.2%(4例)�；颊�30天內死亡原因:急性心肌梗塞1例、肺動脈栓塞1例、C級肝功能衰竭2例。16.9%(30例)患者發(fā)生嚴重并發(fā)癥(Clavien-Dindo分級Ⅲ-Ⅴ級),兩組患者術后嚴重并發(fā)癥發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義。單因素分析提示:腫瘤直徑、肝硬化是影響患者術后嚴重并發(fā)癥的危險因素;腫瘤直徑、大范圍切肝是影響患者術后肝功能衰竭的危險因素。Logistic回歸分析提示,腫瘤直徑是影響患者術后嚴重并發(fā)癥發(fā)生和術后肝功能衰竭的獨立危險因素。本研究納入的患者1、3、5年無瘤生存率為77.0%、55.6%、38.8%;1、3、5年總生存率為89.3%、69.5%、56.0%。CDCA5高表達組患者1、3、5年無瘤生存率為69.7%、46.1%、32.6%;1、3、5年總生存率為86.5%、61.5%、47.8%。CDCA5低表達組患者1、3、5年無瘤生存率為84.3%、64.0%、44.9%;1、3、5年總生存率為89.9%、76.4%、64.0%。CDCA5高表達組患者預后較CDCA5低表達組患者預后差,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。單因素分析提示,CDCA5高表達、肝硬化、腫瘤直徑、大范圍切肝、微血管侵犯是影響患者術后無瘤生存時間和總生存時間的危險因素。Cox回歸多因素分析提示,肝硬化、腫瘤直徑和微血管侵犯是影響患者術后無瘤生存時間的獨立危險因素。腫瘤直徑、微血管侵犯是影響肝癌切除術后患者總生存時間的獨立危險因素。結論:肝癌組織高表達CDCA5組患者腫瘤直徑較大,微血管侵犯發(fā)生率較高且預后較差。進一步研究CDCA5在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制具有實際的臨床價值。第二部分:細胞周期蛋白CDCA5促進肝癌細胞生長作用機制研究目的:CDCA5在肝癌組織中表達增高,且表達量高的患者預后較差。但CDCA5對肝癌細胞生長的調控還缺乏進一步的研究。本部分研究通過細胞實驗和動物實驗,旨在探討CDCA5促進肝癌細胞生長的作用機制。材料與方法:1.材料:SMMC-7721、Hep G2、Huh-7肝癌細胞株、DNA凝膠回收試劑盒、LATaq購于武漢華聯(lián)科生物科技有限公司;去內毒素質粒提取試劑盒購買于OMEG公司;T4 DNA連接酶、內切酶Xho I、Bam H I、Xba I購自NEB公司;慢病毒p Sico R、p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro購自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司;DMEM購自Hyclone公司;青鏈霉素、胎牛血清購自Gibco公司;PBS、0.25%胰蛋白酶、碘化丙啶購自Bioswamp公司;Lipofectamine2000購自Invitrogen公司;Lentiviral Packaging Lentiviral Packaging Kit購自上海翊圣生物科技有限公司;Ribonuclease A(RNase A)購自Ta Ka Ra公司;菌種DH5α由武漢華聯(lián)科生物科技有限公司實驗室保存。2.細胞培養(yǎng)和CDCA5檢測:SMMC-7721、Hep G2、Huh-7細胞用含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。Western blot檢測CDCA5在以上三種肝癌細胞中的表達。3.實驗動物:SPF級BAl B/C-nu/nu裸小鼠,4~6周齡,體重18~20g。購自北京華阜康生物科技股份有限公司。在SPF級動物房內飼養(yǎng)。4.質粒構建:從人肝癌組織中提取總RNA,經(jīng)反轉錄為c DNA,以c DNA為模板通過引物(CDCA5-F:GCTCTAGATGTCTGGGAGGCGAACGC、CDCA5-R:CGGGATCCTCATTCAACCAGGAGATCA)擴增CDCA5基因,將目的基因CDCA5及質粒p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro以Xba I、Bam H I雙酶切,用T4DNA連接酶將目的基因CDCA5連接到質粒p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro上,轉化至DH5α感受態(tài)細胞,挑選陽性克隆,擴大培養(yǎng)后用去內毒質粒提取試劑盒提取質粒,將測序正確的CDCA5過表達質粒命名為p CDH-CDCA5。依據(jù)Gen Bank中CDCA5(NM_080668.3)的序列,利用sh RNA設計程序,設計3個sh RNA干擾靶點序列(sh CDCA5-1、2、3)。并在5'\3'端分別引入Xho I、Bam HⅠ為酶切位點,按照設計原則合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo,將p Sico R載體及合成好的干擾序列雙酶切線性化,通過T4DNA連接酶將干擾片段連接到p Sico R載體,轉化至DH5α感受態(tài)細胞,挑選陽性克隆,擴大培養(yǎng)后用去內毒質粒提取試劑盒提取質粒,將測序正確的CDCA5干擾質粒命名為p Sico R-sh CDCA5-1、-2、-3。5.基因瞬時轉染及鑒定:采用Lipofectamine2000介導的基因轉染方法,將構建的敲低質粒轉染Hep G2細胞,過表達質粒轉染SMMC-7721細胞。實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q PCR)及Western blot檢測轉染效率。6.MTT檢測及克隆形成實驗:收集CDCA5低表達組,CDCA5過表達組及各陰性對照組對數(shù)期細胞。調整細胞懸液濃度,分于96孔板,每孔180μL,每種細胞設3個復孔,并以100μL培養(yǎng)液設空白對照,細胞密度為每孔1000~5000,37℃孵育過夜。按分組,分別轉染12h、24h、48h和72h;取出不同分組的細胞培養(yǎng)板,每孔加20μL MTT溶液(5mg/ml),再培養(yǎng)4小時。吸棄上清后,150μL DMSO溶解液加入每孔,于搖床上低速振蕩10分鐘,以使結晶物充分溶解。各孔490 nm吸光值以在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測。將CDCA5低表達Hep G2細胞、CDCA5過表達SMMC-7721細胞及各組的陰性對照細胞行克隆形成實驗。7.流式細胞術檢測細胞周期:上述感染的CDCA5低表達組Hep G2細胞,CDCA5過表達組SMMC-7721細胞,及各陰性對照組細胞,用0.25%的胰酶消化并轉移至流式細胞管,1000轉/分離心5分鐘。吸棄上清,用300μL含有10%胎牛血清的PBS溶液懸浮沉淀,移入干凈的1.5m L離心管內;加入700μL無水乙醇,置于-20℃冰箱內固定細胞24小時以上。流式細胞術檢測其細胞周期變化。8.裸鼠皮下成瘤實驗:0.25%胰酶消化并計數(shù)上述感染的陰性對照Hep G2細胞,CDCA5低表達組Hep G2細胞,用無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度為1x107個/ml。每只小鼠皮下注射0.2ml各組細胞,自接種之日起每天觀察裸鼠狀態(tài),成瘤時間及瘤體生長情況。第30天處死裸鼠,取出腫瘤,稱重并對比每組腫瘤組織的平均重量。9.統(tǒng)計學分析:正態(tài)分布計量資料的表示采用`c±S表示,非正態(tài)分布計量資料表示采用中位數(shù)(全距)。計量正態(tài)分布兩組間比較采用t檢驗,多組計量數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析,非正態(tài)分布采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料兩組間的對比采用c2檢驗。采用雙側檢驗,P0.05認為有統(tǒng)計學差異。統(tǒng)計學運算采用SPSS軟件(IBM version 22.0,NY,USA)。結果:1.質粒構建及轉染:Western blot檢測到CDCA5在肝癌Hep G2細胞株的表達量顯著高于SMMC-7721、Huh-7細胞株,故選用Hep G2細胞株進行后續(xù)RNA干擾敲低實驗。Western blot檢測sh CDAC5-3質粒敲低最明顯,故選取sh CDAC5-3質粒進行后續(xù)實驗。取表達量最低的SMMC-7721細胞株進行CDCA5過表達實驗。sh CDCA5-3質粒敲低CDCA5以及p CDH-CDCA5質粒轉染過表達CDCA5后,Western blot檢測CDCA5相對表達量分別為0.30、1.01。2.MTT檢測:MTT檢測經(jīng)敲低和過表達CDCA5后Hep G2細胞和SMMC-7721細胞生長情況。經(jīng)轉染12、24、48、72小時后,敲低組Hep G2細胞抑制率分別為(8.40±2.07)%、(14.10±0.53)%、(65.97±0.58)%、(70.10±1.04)%。隨著轉染時間延長,CDCA5敲低組Hep G2肝癌細胞增殖率明顯受抑制;過表達組SMMC-7721細胞存活率分別為(102.83±1.56)%、(116.23±1.01)%、(128.93±0.95)%、(130.03±0.35)%。隨著轉染時間延長,CDCA5過表達組SMMC-7721肝癌細胞存活率明顯增強。3.細胞平板克隆形成實驗:CDCA5敲低后,Hep G2細胞克隆形成率(16.40±1.75)%,而陰性對照組細胞克隆形成率為(32.17±3.25)%(P0.05)。CDCA5敲低后,Hep G2細胞增殖能力減弱,形成的克隆數(shù)目較少。CDCA5過表達后,SMMC-7721細胞克隆形成率為(51.93±3.46)%,而陰性對照組細胞克隆形成率為(34.57±4.86)%(P0.05)。CDCA5過表達后,SMMC-7721細胞增殖能力增強,形成的克隆數(shù)目增多。4.流式細胞術檢測細胞周期:流式細胞術檢測CDCA5敲低組、陰性對照組Hep G2肝癌細胞周期。與陰性對照組Hep G2細胞相比,CDCA5敲低組G2期細胞明顯增多,提示敲低CDCA5后,肝癌Hep G2細胞生長的抑制是在G2期被阻滯。p CDH-CDCA5過表達CDCA5的SMMC-7721細胞與陰性對照SMMC-7721細胞相比,細胞周期差異無明顯變化。5.裸鼠皮下成瘤實驗:裸鼠皮下注射陰性對照Hep G2細胞及CDCA5低表達的Hep G2細胞。注射陰性對照Hep G2細胞組的裸鼠,平均第5天皮下出現(xiàn)腫瘤;而注射CDCA5低表達組肝癌Hep G2細胞的裸鼠,平均第6天皮下出現(xiàn)腫瘤。注射第30天,陰性對照Hep G2細胞組、CDCA5低表達組裸鼠瘤體重量分別為0.89±0.07克,0.66±0.11克。CDCA5低表達組瘤體重量明顯低于陰性對照Hep G2細胞組,兩組間對比有統(tǒng)計學差異(P0.05)。免疫組化檢測CDCA5在小鼠成瘤組織中的表達提示,CDCA5在低表達組腫瘤組織中表達降低(P0.05)。結論:CDCA5能明顯促進肝癌細胞的增殖能力,通過調控CDCA5對抑制肝癌細胞的生長有一定意義。進一步研究可針對CDCA5調控肝癌細胞增殖的相關信號通路來進行。第三部分:CDCA5促進肝癌細胞生長的信號轉導機制研究目的:為了進一步分析CDCA5在致癌過程中的作用,我們關注可能磷酸化CDCA5的蛋白,及可能參與的信號通路。在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn),CDCA5被ERK磷酸化。本部分研究旨在探討CDCA5促進肝癌細胞生長的信號轉導機制。材料與方法:1.材料:Hep G2肝癌細胞株購自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司。U0126購自Biovison公司。ERK1、ERK2、CDCA5兔抗人抗體購自Abcam公司;phospho-p44/42MAPK(e RK1/2)(t HR202/t YR204)、GAPDH兔抗人抗體購自Cell Signaling Technology公司;二抗Goat anti rabbit Ig G購自Bioswamp公司。2.細胞培養(yǎng):采用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行Hep G2細胞培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。3.EGF及U0126刺激Hep G2細胞:EGF為MAPK信號通路激活劑,U0126為MEK抑制劑。實驗組以50ng/m L濃度的EGF和10mmol/L濃度的U0126共同刺激肝癌Hep G2細胞。對照組僅以50ng/m L濃度的EGF刺激Hep G2細胞。分別刺激15分鐘、30分鐘、60分鐘。4.Western blot檢測ERK1、ERK2、p-ERK1/2和CDCA5表達:離心搜集細胞,在細胞中加入蛋白裂解混合液,4℃充分裂解細胞。12000g離心5分鐘,取上清進行蛋白質定量后貯存于-80℃冰箱。以Western blot檢測ERK1、ERK2、p-ERK1/2和CDCA5表達。5.統(tǒng)計學分析:采用Image J軟件計算Western blot測得的蛋白表達灰度值,以目的蛋白測定值與GAPDH比值作為蛋白相對表達量。所有統(tǒng)計采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學運算。結果:1.EGF刺激肝癌Hep G2細胞對ERK1、ERK2、p ERK1/2和CDCA5表達的影響:EGF刺激肝癌Hep G2細胞后,在刺激的15分鐘、30分鐘,p ERK1/2表達明顯上調,而CDCA5隨著EGF刺激時間延長而表達逐漸增加。EGF刺激的第60分鐘,p ERK1/2表達量較EGF刺激15分鐘、30分鐘降低。EGF刺激Hep G2細胞后,Western blot檢測總ERK1、ERK2變化無顯著性差異。2.EGF和U0126刺激肝癌Hep G2細胞對ERK1、ERK2、p ERK1/2和CDCA5表達的影響:U0126可抑制EGF所刺激的p ERK1/2表達,而CDCA5表達量也隨著p ERK1/2表達降低而逐漸降低。EGF及U0126共刺激Hep G2細胞后,Western blot檢測總ERK1、ERK2變化無顯著性差異。結論:CDCA5隨p ERK1/2的變化而變化,提示CDCA5可能參與MAPK信號通路,并可能被p ERK1/2所調控。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
【圖文】：

A B 1. 免疫組織化學顯示 CDCA5 在正常肝臟組織（A）和肝癌組織（B）中表達（DAB 染色，蘇木素復染，放大倍數(shù)：×400）。1.2 肝癌組織與癌旁組織 CDCA5 表達情況。（圖 2）圖 2. 免疫組織化學顯示 CDCA5 在肝癌及癌旁組織 CDCA5 表達。（DAB 染色，蘇木素復染，放大倍數(shù)：×200）。1.3 CDCA5 截斷值設定

1.1 CDCA5 在肝癌組織中的表達情況CDCA5 在肝癌組織中表達量明顯增高。而正常肝臟組織中 CDCA5 表達量較圖 1）。A B 1. 免疫組織化學顯示 CDCA5 在正常肝臟組織（A）和肝癌組織（B）中表達（DAB 染色，蘇木素復染，放大倍數(shù)：×400）。1.2 肝癌組織與癌旁組織 CDCA5 表達情況。（圖 2）

【參考文獻】

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本文編號：2720541