【摘要】：研究背景與目的:循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells;CTC)是液體活檢中一個重要的組成部分。目前CTC檢測方法基本都遵循了“先富集后鑒定”的兩步原則,但遺憾的是,富集過程通常繁瑣且導(dǎo)致CTC的損失,而且由于缺乏腫瘤特異性標志物因此難以有效的鑒定一個細胞是否確實為腫瘤細胞,這為CTC檢測的可靠性帶來了很大的挑戰(zhàn)。腫瘤細胞能量代謝異常是腫瘤的普遍性特征之一,對于葡萄糖攝取高于一定閾值的組織就可被鑒定為惡性腫瘤組織。因此我們提出了一種通過腫瘤細胞能量代謝異常來鑒定CTC的方案,即:通過一種熒光標記的葡萄糖類似物來檢測液體樣本中所有有核細胞的葡萄糖攝取;同時考慮到腫瘤還存在其他代謝途徑,利用其他碳源作為能量來源,因此我們還嘗試了將氧化還原代謝標志物與葡萄糖代謝標志物聯(lián)合使用鑒定CTC,以實現(xiàn)更高的檢測靈敏度。通過這一高通量方法能夠快速在海量細胞中找到高代謝活性的疑似腫瘤細胞,由于是功能檢測因此不損害細胞活性,不會影響單細胞基因組擴增從而干擾測序結(jié)果,并且可以進行RNA檢測。最后為了驗證這一方法的準確性,疑似腫瘤細胞最終通過單細胞測序加以確認。研究方法及結(jié)果:第一部分:我們制作了可尋址微孔的芯片,通過熒光標記的葡萄糖類似物2-NBDG、白細胞標志物CD45、死細胞染料EthD-1,在肺癌患者的胸水樣本、血液樣本中標記;通過高內(nèi)涵成像系統(tǒng)對芯片中的細胞進行快速成像與分析,鑒定出疑似的腫瘤細胞;最后通過顯微操作,提取單細胞進行測序,并與原位組織的驅(qū)動基因情況進行比較,確認其可靠性。結(jié)果表明:在10例已知驅(qū)動基因肺癌患者的胸水樣本中,均檢測到具有高代謝活性的疑似腫瘤細胞,所有患者的單細胞測序發(fā)現(xiàn)驅(qū)動基因突變,因此可以確認該細胞即為腫瘤細胞。然后我們在2例已知驅(qū)動基因突變狀態(tài)患者的血液樣本中,用類似的方法,找到高代謝的腫瘤細胞,并通過單細胞測序加以確認。第二部分:通過第一部分類似的細胞捕捉與標記的方法,我們用另外一種氧化還原指示劑刃天青(Resazurin)和葡萄糖類似物2-NBDG同時在肺癌患者的胸水樣本中標記腫瘤細胞,結(jié)果表明:26例肺腺癌患者的胸腔積液中,用兩組代謝物標記物標記的疑似腫瘤細胞群并不完全一致;肺癌患者的胸腔積液中除了有高葡萄糖代謝的腫瘤細胞之外,還存在一部分低葡萄糖攝取卻具有高度刃天青活性的腫瘤細胞,并且所有的細胞均通過單細胞測序確認為腫瘤細胞;這兩群有不同代謝標記的細胞可能有不同的生物學(xué)表征。研究結(jié)論:我們研究表明:基于細胞代謝活性的這一高通量方法簡便、快速;可以在短時間內(nèi)檢測大量細胞,減少稀少腫瘤細胞丟失的可能,同時極大的簡化了檢測流程并降低了成本;用氧化還原指示劑刃天青(Resazurin)和葡萄糖類似物2-NBDG兩種代謝標志物的協(xié)同使用能夠進一步提高惡性胸腔積液的檢測靈敏度。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
【圖文】：

的十大基本特征（圖 4），其中包括：維持增殖信號通路，逃避生長抑制，抑胞死亡，無限自我復(fù)制，誘導(dǎo)血管生成，激活浸潤轉(zhuǎn)移，避免免疫殺傷，促進炎癥，能量代謝異常以及基因組不穩(wěn)定等。這些基本特征是惡性細胞獨有的，中除了能量代謝異常外，其他特征卻難以方便地在單細胞程度上進行高通量測。

- 30 -圖 1-1：圖中為直徑為 25μm 的芯片，大概可以容納 14 萬個細胞，共包含 400 個編號區(qū)域，其中每個編號區(qū)域包含 277 個 25um 直徑的微孔。Fig1-1：Amicrowell chip has 140,000 microwells with a diameter and the height of 25 μm, a totalof 400 numbered regions, each of which contains 277 micropores1.4.2 2-NBDG/ EthD-1/CD45 檢測結(jié)果我們選擇非腫瘤患者作為對照，用于比較 2-NBDG 攝取情況在白細胞與 A549細胞中是否存在差異。我們從上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院獲取 3 名非腫瘤患者的血液樣本，CD45-APC 抗體標記血液中的白細胞。結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過 2-NBDG

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本文編號：2718120