【摘要】：研究背景:染色體濃縮調(diào)節(jié)因子 2(Regulator of chromosome condensation 2,RCC2)也稱作TD60,位于染色體1p36.13位點。其編碼的蛋白質(zhì)屬于染色體乘客復(fù)合體(chromosomal passenger complex,CPC)的一員,參與細胞有絲分裂和紡錘體的組裝,并與細胞的定向遷移有關(guān)。腫瘤重要的病理特征就是細胞異常增殖和細胞轉(zhuǎn)移。有研究報道,RCC2與腫瘤發(fā)病有關(guān),在腫瘤發(fā)病過程中發(fā)揮作用。例如,有報道稱RCC2與黑色素瘤及皮膚基底細胞癌的復(fù)發(fā)相關(guān);RCC2表達在胃癌組織中顯著上調(diào),并在臨床上可用于篩選結(jié)直腸癌高危病人;RCC2表達能促進非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移等。以上種種證據(jù)說明RCC2表達是腫瘤發(fā)病過程中的重要因素。乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤,它的發(fā)生率占女性惡性腫瘤總數(shù)的30%,并且近幾年有不斷上升的趨向。腫瘤細胞的生物學(xué)行為如增殖、遷移、凋亡關(guān)系到乳腺癌的發(fā)展及預(yù)后,與腫瘤致癌基因、抑癌基因信號通路異常密切相關(guān),但確切的分子機制尚未完全了解。因此,探究乳腺癌相關(guān)的細胞及分子機制、尋找有效的診斷、預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點對診斷乳腺癌及判斷預(yù)后具有十分重要的作用。RCC2被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥病變有關(guān)使我們推斷RCC2可能也與乳腺癌相關(guān),但至今尚未有關(guān)于RCC2對乳腺癌作用的體外和體內(nèi)研究報道。因此,本課題計劃研究RCC2在乳腺癌組織中的表達及作用機制。雌激素受體陽性型乳腺癌為乳腺癌中最常見的類型。因此在探究RCC2與乳腺癌的致病及其調(diào)控機制的同時,我們也研究雌激素在乳腺癌中扮演的重要角色及是否通過RCC2發(fā)揮作用。本研究通過從臨床乳腺組織標(biāo)本、培養(yǎng)乳腺癌細胞模型及乳腺癌荷瘤動物模型三個方面探索RCC2在乳腺癌中的致病機制,闡明RCC2對乳腺癌病變的作用,為進一步闡明乳腺癌發(fā)病機制提供新的思路。方法:1.收集乳腺組織標(biāo)本32例,其中雌激素受體陽性(Estrogen receptor positive,ER+)乳腺癌組織16例,雌激素受體陰性(Estrogen receptor negative,ER-)乳腺癌組織9例,乳腺纖維瘤組織7例。提取總蛋白,用western blot檢測不同類型乳腺組織RCC2的蛋白表達水平。2.以最常見的乳腺癌細胞系MCF-7(ER+)為細胞模型,用瞬時轉(zhuǎn)染方法將特異的小干擾RNA(si-RCC2)導(dǎo)入細胞抑制RCC2的表達,也用瞬時轉(zhuǎn)染方法將過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-RCC2-RFP)導(dǎo)入細胞使RCC2過表達,用Real-time PCR和western blot檢測RCC2在mRNA及蛋白水平的表達。觀察RCC2的改變對細胞增殖、細胞遷移以及細胞凋亡的影響。3.用瞬時轉(zhuǎn)染法抑制RCC2在MCF-7細胞內(nèi)表達后,以無意義小干擾片段轉(zhuǎn)染的 MCF-7 細胞為對照組,采用 PAHS-131ZA Human Breast Cancer RT2 ProfilerTM PCR Array芯片觀察乳腺癌相關(guān)信號通路中84個相關(guān)基因表達量有無明顯變化。用Real-time PCR和Western blot分別在mRNA及蛋白水平驗證變化趨勢,篩選RCC2可能調(diào)控的下游基因。4.由吉瑪公司制備可抑制RCC2表達的慢病毒和空載慢病毒,用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法分別將兩種慢病毒導(dǎo)入乳腺癌細胞系MCF-7。選用4-5周雌性裸鼠BALB/C Nude,皮下注射抑制RCC2表達的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)乳腺癌細胞系MCF-7,構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型。同時以空載慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)乳腺癌細胞系MCF-7作為對照組。測量腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線,磁共振成像技術(shù)檢測腫瘤表觀彌散系數(shù)(Apparent Diffusion Coefficient,ADC),稱量瘤體重量,以觀察RCC2表達的改變對裸鼠皮下瘤體生長的影響。5.用不同濃度雌激素處理培養(yǎng)MCF-7細胞。觀察不同濃度雌激素對RCC2基因蛋白表達的影響。用最佳濃度10-8mol/L雌激素處理培養(yǎng)MCF-7細胞。觀察雌激素對PCR Array芯片篩選出的RCC2下游基因即堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(Twist Family BHLH Transcription Factor 1,TWIST 1)和胰島素樣生長因子 1(Insulin-Like Growth Factor 1,IGF1)mRNA及蛋白表達的影響。觀察雌激素與RCC2共同作用于MCF-7細胞時對細胞增殖及凋亡的影響。結(jié)果:1.ER+乳腺癌組織(n=16)、ER-乳腺癌組織(n=9)及乳腺纖維瘤組織(n=7)各組間RCC2蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.497,P=0.001)。多重比較顯示,乳腺纖維瘤組織(0.284±0.085)與ER+乳腺癌組織(0.795±0.342)和ER-乳腺癌組織(0.569±0.153)相比RCC2蛋白表達水平均低(P0.001,P=0.039),且ER+乳腺癌組織比ER-乳腺癌組織RCC2蛋白表達水平高(P=0.048)。說明RCC2在乳腺癌組織中呈高表達,且在ER+乳腺癌組織中RCC2表達量高于ER-乳腺癌組織。2.與無意義小干擾片段處理的對照組相比,小干擾RNA(si-RCC2)成功在mRNA及蛋白水平上抑制MCF-7細胞內(nèi)RCC2的表達(P=0.019,P=0.017)。與空載質(zhì)粒處理的對照組相比,過表達質(zhì)粒成功使MCF-7細胞RCC2表達量升高(P0.001)。抑制RCC2的表達后MCF-7細胞遷移能力明顯減弱(P4day=0.004),細胞凋亡比例明顯增加(P=0.037),但細胞增殖無明顯變化(F處理=0.003,P=0.957);過表達RCC2可使MCF-7細胞遷移能力明顯增強。(P4day=0.009),細胞凋亡比例明顯減少(P=0.037),但細胞增殖無明顯變化(F處理=2.304,P=0.149)。說明RCC2表達可促進MCF-7細胞遷移,抑制MCF-7細胞凋亡。3.MCF-7細胞內(nèi)抑制RCC2表達后,與無意義小干擾片段處理的對照組相比PAHS-13]ZA Human Breast Cancer RT2 ProfilerTM PCR Array 芯片共篩查出 3 個表達量變化≥2倍的基因。其中IGF1表達下調(diào)2.60倍,神經(jīng)遷移因子2(Slit Guigance Ligand 2,SLIT2)表達上調(diào) 223 倍,TWIST1 表達下調(diào) 2.53 倍。Real-time PCR證實在抑制RCC2表達后,TWIST1及IGF 1的mRNA表達水平下降(P=0.019,P=0.013),與 PCRArray 結(jié)果一致;而 SLIT2 的 mRNA 表達水平在抑制RCC2表達前后無明顯變化(P=0.832)。繼續(xù)用western blot驗證,發(fā)現(xiàn)抑制RCC2表達后,TWIST1及IGF1蛋白表達水平均顯著下降,分別下降約46.3%和35.9%(P=0.036,P=0.007)。說明RCC2正向調(diào)控人乳腺癌信號通路中的TWIST1和IGF1基因。4.皮下注射抑制RCC2表達的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)乳腺癌細胞系MCF-7,成功構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型。與空載慢病毒處理的對照組裸鼠相比,用抑制RCC2表達的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)乳腺癌細胞系MCF-7細胞構(gòu)建的裸鼠腫瘤生長緩慢,瘤體體積減小(P=0.002),瘤體重量減小(P=0.001),ADC值升高(P=0.044),說明抑制MCF-7細胞內(nèi)RCC2的表達可延緩裸鼠皮下腫瘤的生長。5.與含0.1%乙醇處理的對照組相比,104-10-12mol/L濃度范圍內(nèi)雌激素可促進MCF-7細胞表達RCC2,且在雌激素濃度為10-8mol/L時RCC2蛋白表達量最高。與含0.1%乙醇處理的對照組相比,10-8mol/L雌激素也可促進PCRArray芯片篩選出的乳腺癌信號通路相關(guān)基因TWIST1和IGF1在MCF-7細胞的表達(P=0.018,P=0.046),蛋白水平分別升高約1.90倍及1.34倍。與含0.1%乙醇處理的對照組相比,雌激素本身促進細胞增殖(P0.001),但在雌激素存在下RCC2表達量的改變對細胞增殖無明顯影響(P=0.200,P=0.101);在雌激素存在的情況下抑制RCC2的表達時細胞凋亡率增加(P=0.020),促進RCC2的表達時細胞凋亡率下降(P=0.019)。說明雌激素通過RCC2正向調(diào)控IGF1和TWIST1的表達從而促進腫瘤生長。結(jié)論:1.RCC2在乳腺癌組織中呈高表達,且在ER+乳腺癌組織中RCC2表達量高于ER-乳腺癌組織。2.RCC2表達可促進MCF-7細胞遷移,抑制MCF-7細胞凋亡。3.RCC2正向調(diào)控人乳腺癌信號通路中的TWIST1和IGF1基因。有報道,TWIST1有誘導(dǎo)細胞遷移、侵襲以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用,IGF1在細胞增殖、分化及抑制凋亡方面有重要作用。4.裸鼠皮下成瘤模型中抑制慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系MCF-7內(nèi)RCC2的表達延緩裸鼠皮下腫瘤生長。5.雌激素通過RCC2正向調(diào)控IGF1和TWIST1的表達從而促進腫瘤生長。上述結(jié)果建議RCC2是乳腺癌致癌基因,雌激素通過刺激RCC2表達及其下游TWIST1和IGF1表達來抑制細胞凋亡和促進細胞轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9
【圖文】：

圖１．邋ＲＣＣ２在乳腺組織中的蛋白表達。逡逑（Ａ）邐Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測ＥＲ＋乳腺癌組織目的蛋白條帶。逡逑（Ｂ）邐Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測ＥＲ－乳腺癌組織目的蛋白條帶。逡逑（Ｃ邋）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測乳腺纖維瘤組織目的蛋白條帶。逡逑（Ｄ）用ＩｍａｇｅＪ軟件將ＲＣＣ２蛋白表達量化并用內(nèi)參ＧＡＰＤＨ校準(zhǔn)后的相對蛋逡逑白表達程度。＊Ｐ＜0．0５；邋＊＊＊Ｐ＜０．００１。逡逑

圖２．轉(zhuǎn)染ｓｉ－ＲＮＡ／過表達質(zhì)粒后，ＭＣＦ－７細胞ＲＣＣ２的ｍＲＮＡ、蛋白表達水逡逑平。逡逑（Ａ）邐Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測ＭＣＦ－７細胞轉(zhuǎn)染ｓｉ－ＲＮＡ７２ｈ后ＲＣＣ２的蛋白表達。逡逑（Ｂ）邐Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測ＭＣＦ－７細胞轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒７２ｈ后ＲＣＣ２的蛋白表達。逡逑（Ｃ邋）實時熒光定量ＰＣＲ檢測ＭＣＦ－７細胞轉(zhuǎn)染ｓｉＲＮＡ邋４８ｈ后ＲＣＣ２的ｍＲＮＡ逡逑表達。＊Ｐ＜０．０５ｖｓ邋Ａｌｌｓｔａｒｓ－ｓｉＲＮＡ邋組。逡逑（Ｄ）實時熒光定量ＰＣＲ檢測ＭＣＦ－７細胞轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒４８ｈ后ＲＣＣ２的ｍＲＮＡ逡逑表達。＊＊＊尸＜０．００１ｖｓＯ－ＲＦＰ邋組。逡逑

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