發(fā)布時(shí)間：2020-06-15 13:33

【摘要】：研究背景乳腺癌是世界上女性最常見的惡性腫瘤,也是最常見的女性惡性腫瘤死因。2012年全世界新增乳腺癌患者約167萬例,占女性惡性腫瘤患者總量的25%;乳腺癌死亡患者約52.19萬例,占女性惡性腫瘤死亡患者總量的15%。由于快速城市化及生活方式改變的影響,乳腺癌發(fā)病率在世界范圍內(nèi)仍然呈上漲趨勢(shì)。2015年,中國(guó)新增女性乳腺癌患者約26.86萬例,占女性惡性腫瘤總量的15.1%;乳腺癌死亡患者約6.95萬例,占女性惡性腫瘤死亡總量的6.9%。腫瘤細(xì)胞的耐藥性導(dǎo)致乳腺癌治療失敗的主要原因。因此,乳腺癌耐藥關(guān)鍵因子、作用靶點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)提高腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性具有重要意義。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase,PARP)是存在于真核細(xì)胞中的一種核酶,含有多種亞型,如:PARP1、PARP2和PARP3等。PARP1首先被發(fā)現(xiàn),它在細(xì)胞生理(如基因組穩(wěn)定性)與病理過程(如惡性腫瘤發(fā)生、治療抵抗)中都發(fā)揮著重要作用。許多研究證實(shí)PARP1與腫瘤細(xì)胞的耐藥性關(guān)系密切。烷化劑是一種廣泛使用的抗腫瘤藥物,有一個(gè)或多個(gè)高度活躍的烷化基團(tuán),能和腫瘤細(xì)胞的DNA相結(jié)合,使得快速生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生DNA損傷,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。PARP1是DNA損傷的重要感受器和信號(hào)傳導(dǎo)器,當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí),PARP1被激活并參與損傷DNA的修復(fù),而當(dāng)PARP 1的表達(dá)受到抑制時(shí),PARP1介導(dǎo)的損傷DNA修復(fù)機(jī)制也會(huì)受到抑制,因此能夠減輕或者逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的烷化劑耐藥性。目前,PARP1是最有潛力的抗癌藥物分子靶點(diǎn)之一。微小RNA(microRNA,miRNA)是由18-25個(gè)核苷酸組成的高度保守的單鏈非編碼的小分子RNA。作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,miRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶mRNA的3'非編碼區(qū)域(untranslated region,UTR)相結(jié)合,可以降低靶mRNA的水平(降解靶mRNA)或降低靶mRNA所編碼的蛋白水平(抑制mRNA翻譯)。盡管miRNA僅占整個(gè)人類基因組的3%,但是miRNA調(diào)控著人體20%～30%的mRNA。超過50%的miRNA位于基因組的脆弱位點(diǎn)或參與腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域,因此,miRNAs與腫瘤的關(guān)系非常密切。越來越多的證據(jù)表明,miRNA在腫瘤發(fā)展與治療抵抗中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。2013年,Riaz等發(fā)現(xiàn)miRNA-891b在BRCA1突變的乳腺癌細(xì)胞珠中高表達(dá),提示miRNA-891b可能與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。通過檢索 TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.targetscan.org/vert_71/),我們發(fā)現(xiàn) PARP1 的 3'UTR中可能含有miR-891b的結(jié)合位點(diǎn),提示miR-891b可能參與PARP1表達(dá)調(diào)控,可能與烷化劑耐藥有關(guān)。本研究,主要探討miR-891b對(duì)乳腺癌細(xì)胞烷化劑藥物的敏感性的調(diào)節(jié),希望能尋找新的有效靶點(diǎn)。研究目的本研究主要探索miR-891b對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1806烷化劑藥物敏感性的調(diào)節(jié)作用,包括三個(gè)方面的研究。第一,探究miR-891b與PARP1的靶向作用關(guān)系;第二,研究miR-891b對(duì)細(xì)胞HCC1806藥物敏感性的調(diào)控作用;第三,探討PARP1對(duì)細(xì)胞HCC1806藥物敏感性的作用。研究方法第一部分:首先,檢索TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù),以尋找miR-891b與PARP1的結(jié)合位點(diǎn),然后應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增該結(jié)合位點(diǎn)片段,并將目的基因片段與pmirGLO載體連接,構(gòu)建PARP1-3' UTR報(bào)告基因載體。然后將PARP1-3'UTR報(bào)告基因載體-miR-891b mimics或PARP1-3'UTR報(bào)告基因載體-miR-891b NC分別共轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞HCC1806中,利用熒光素酶報(bào)告基因分析法檢測(cè)miR-891b與PARP1-3'UTR的是否具有結(jié)合位點(diǎn)。然后利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將miR-891b mimics和miR-891b NC分別轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞HCC1806中,最后使用qRT-PCR檢測(cè)miR-891b水平變化,Western blot檢測(cè)PARP1的蛋白表達(dá)水平變化。第二部分:在研究miR-891b對(duì)細(xì)胞HCC1806藥物敏感性的調(diào)控作用時(shí),首先將miR-891b mimics和miR-891b NC分別轉(zhuǎn)染到細(xì)胞HCC1806中,轉(zhuǎn)染48h后,將細(xì)胞置于含40μM甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含MNNG的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。然后利用MTT法檢測(cè)miR-891b mimics + MNNG組、miR-891b mimics 組、miR-NC 組和 miR-NC + MNNG 組的細(xì)胞增殖情況,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡。第三部分:為進(jìn)一步研究PARP1在乳腺癌細(xì)胞HCC1806藥物敏感性的作用,我們構(gòu)建了 PARP1表達(dá)質(zhì)粒,并將miR-891b mimics+pBABE 和 miR-891b mimics + PARP1 表達(dá)質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞HCC1806中,轉(zhuǎn)染48 h后,將細(xì)胞置于含40 μM MNNG的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)1h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含MNNG的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PARP1的蛋白表達(dá)水平,利用MTT法和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況與凋亡情況。研究結(jié)果第一部分:通過檢索TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù),我們發(fā)現(xiàn)PARP1中可能含有miR-891b的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因分析提示,與共轉(zhuǎn)染miR-891b NC+PGL3-PARP1-3'UTR的對(duì)照組細(xì)胞相比,共轉(zhuǎn)染miR-891b mimics+PGL3-PARP1-3'UTR的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中熒光素酶的活性顯著降低(P0.01)。與轉(zhuǎn)染miR-891b NC的對(duì)照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染miR-891b mimics的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的miR-891b的表達(dá)水平明顯上升。Western blot檢測(cè)PARP1的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染miR-891b NC的對(duì)照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染miR-891b mimics的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PARP1的蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降。通過對(duì)PARP1蛋白表達(dá)水平與Tubulin的蛋白表達(dá)水平的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-891b mimics的試驗(yàn)細(xì)胞中PARP1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照相比顯著下降(P0.01)。第二部分:MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn),miR-NC + MNNG組的乳腺癌細(xì)胞HCC1806的增殖活性顯著低于miR-NC組,miR-891b mimics + MNNG組的細(xì)胞增殖活性低于miR-891b組,miR-891b mimics + MNNG組的細(xì)胞增殖活性低于miR-NC + MNNG組。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞HCC1806的凋亡情況,發(fā)現(xiàn)miR-891b + MNNG組的細(xì)胞凋亡率要顯著高于miR-891b組(P0.01)和 miR-NC + MNNG組(P0.01)。第三部分:通過Western blot檢測(cè)PARP1的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),向乳腺癌細(xì)胞HCC1806轉(zhuǎn)染miR-891b mimics后,細(xì)胞中PARP1的蛋白表達(dá)水平顯著下降;當(dāng)向細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)入PARP1表達(dá)質(zhì)粒時(shí),細(xì)胞中PARP1的蛋白表達(dá)水平又會(huì)恢復(fù)。MTT法和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況發(fā)現(xiàn),與miR-891b mimics組細(xì)胞相比,miR-891b + PARP1組細(xì)胞的增殖能力恢復(fù),細(xì)胞凋亡也顯著下降(P0.01)。研究結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)miR-891b能夠與PARP1的3'UTR靶向結(jié)合。在HCC1806細(xì)胞中,miR-891b的表達(dá)上調(diào)能夠抑制PARP1的蛋白表達(dá),說明miR-891b能夠負(fù)向調(diào)控PARP1的蛋白表達(dá)。MNNG能抑制乳腺癌細(xì)胞HCC1806的增殖,過表達(dá)miR-891b增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞HCC1806對(duì)MNNG的敏感性,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。在過表達(dá)miR-891b的細(xì)胞中恢復(fù)PARP1的表達(dá)時(shí),能夠降低乳腺癌細(xì)胞HCC1806對(duì)MNNG的藥物敏感性。此研究說明miR-891b能通過靶向沉默PARP1的表達(dá)來增加乳腺癌細(xì)胞HCC1806對(duì)烷化劑MNNG的敏感性,而miR-891b的這種作用類似于PARP1抑制劑,有望用于藥物靶點(diǎn)的開發(fā)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9
【圖文】：

檢索邋ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ邋數(shù)據(jù)庫(kù)（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／ｖｅｒｔ＿７１／），逡逑發(fā)現(xiàn)ｍｉＲ－８９１ｂ可能與ＰＡＲＰｌ的３’ＵＴＲ結(jié)合，提示ｍｉＲ－８９１ｂ可逡逑能參與ＰＡＲＰｌ表達(dá)的調(diào)控，其結(jié)合位點(diǎn)如圖１．］邋Ａ所示。為進(jìn)一逡逑步驗(yàn)證ｍｉＲ－８９１ｂ與ＰＡＲＰｌ的３’ＵＴＲ是否存在結(jié)合位點(diǎn)，我們用逡逑酶切連接的方法構(gòu)建了邋ＰＡＲＰ邋１－３’ＵＴＲ報(bào)告基因載體，然后向細(xì)胞逡逑ＨＣＣ１８０６邋中分別共轉(zhuǎn)染邋ｍｉＲ－８９１ｂ邋ｍｉｍｉｃｓ＋邋ＰＡＲＰ］－３’ＵＴＲ邋報(bào)告基逡逑因載體和ｍｉＲ－８９１ｂ邋ＮＣ＋邋ＰＡＲＰ１－３’ＵＴＲ報(bào)告基因載體，培養(yǎng)２４邋ｈ逡逑４０逡逑

殖活性低于ｍｉＲ－ＮＣ組，ｍｉＲ－８９］ｂ邋ｍｉｍｉｃｓ邋＋邋ＭＮＮＧ組的增殖活性逡逑也低于ｍｉＲ－８９１ｂ組，通過比較還發(fā)現(xiàn)，ｍｉＲ－８９１ｂ邋ｍｉｍｉｃｓ邋＋邋ＭＮＮＧ逡逑組的增殖活性低于ｍｉＲ－ＮＣ邋＋邋ＭＮＮＧ組，結(jié)果如圖２．１所示。說逡逑明藥物ＭＮＮＧ能抑制乳腺癌細(xì)胞ＨＣＣ丨８０６的增殖，過表達(dá)逡逑ｍｉＲ－８９１邋ｂ能夠增強(qiáng)ＭＮＮＧ對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，也就是逡逑說，ｍｉＲ－８９邋ｌｂ的過度表達(dá)增加了乳腺癌細(xì)胞ＨＣＣ１８０６對(duì)ＭＮＮＧ逡逑藥物的敏感性。逡逑６２逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2714489