【摘要】：研究目的:乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,也是女性癌癥死亡的主要原因。我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率逐年上升,據(jù)估計(jì)到2021年我國(guó)55-69歲婦女的乳腺癌發(fā)病率將達(dá)到100/10萬(wàn)�；熓侨橄侔┲委煹闹匾侄�,而腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致乳腺癌患者化療失敗的主要因素,并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。此外,盡管乳腺癌治療已取得顯著進(jìn)展,仍有30%乳腺癌患者面臨轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的巨大威脅。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,乳腺癌通常是無(wú)法治愈的。深入揭示乳腺癌耐藥及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,鑒定新的干預(yù)靶點(diǎn),建立逆轉(zhuǎn)耐藥、控制轉(zhuǎn)移的有效方法,一直是乳腺癌研究的重要課題。Spindlin1(SPIN1)是SPIN/SSTY家族的成員,其在卵巢癌和脂肪肉瘤中高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)microRNA-489可抑制乳腺癌細(xì)胞的耐藥性、增殖和遷移浸潤(rùn)能力,SPIN1是microRNA-489的直接靶基因。我們推測(cè),SPIN1也可能在乳腺癌耐藥及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。目前SPIN1在乳腺癌耐藥及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究使用免疫組化的方法檢測(cè)了 SPIN1在乳腺癌組織中的表達(dá)情況,分析了其與乳腺癌化療反應(yīng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。通過(guò)體內(nèi)外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)研究了 SPIN1對(duì)乳腺癌細(xì)胞耐藥及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的影響,并使用基因表達(dá)芯片篩選、熒光素酶實(shí)驗(yàn)、western blot等手段初步探究了其可能的上下游分子機(jī)制。本研究有望為SPIN1成為乳腺癌診療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。研究方法:使用免疫組化、實(shí)時(shí)定量PCR、生物信息學(xué)分析探究SPIN1在乳腺癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)情況,分析SPIN1表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。使用細(xì)胞增殖、凋亡、遷移浸潤(rùn)、耐藥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SPIN1、miRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,裸鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證miRNA介導(dǎo)的SPIN1異常表達(dá)對(duì)乳腺癌化療耐藥的作用。使用基因表達(dá)芯片、pathway富集分析、實(shí)時(shí)定量PCR、western blot鑒定SPIN 1調(diào)節(jié)的靶基因及參與的信號(hào)通路。使用TargetScan、microRNA.org和starBase預(yù)測(cè)可能調(diào)控SPIN1的miRNA,通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)及western blot驗(yàn)證miRNA對(duì)SPIN1的調(diào)節(jié)作用。進(jìn)行細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)探究miRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞耐藥性的影響。利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)采用生物信息學(xué)方法分析SPIN1下游靶基因及上游miRNA的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果:(1)SPIN1在乳腺癌中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示SPIN1蛋白在乳腺癌化療耐藥組織較化療敏感組織表達(dá)上調(diào),在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達(dá)高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。ROC曲線分析顯示SPIN1表達(dá)可以明顯地區(qū)分耐藥組織與敏感組織,及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。臨床病理參數(shù)分析提示SPIN1高表達(dá)與化療耐藥、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期或臨床分期、孕激素受體陽(yáng)性相關(guān)。從GENT數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了 GEO數(shù)據(jù)集GSE22513標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù),結(jié)果顯示,相比于獲得病理完全緩解(pCR)的病例,未獲得病理完全緩解的病例(non-pCR)化療前穿刺乳腺癌組織中SPIN1表達(dá)水平上調(diào)。此外,乳腺癌細(xì)胞系中SPIN1mRNA檢測(cè)結(jié)果顯示,MCF-7細(xì)胞中SPIN1表達(dá)水平最低;相比于化療敏感、低轉(zhuǎn)移性的MCF-7細(xì)胞,SPIN1在化療耐藥的MCF-7/ADM、高轉(zhuǎn)移性的MDA-MB-231及MDA-MB-468中表達(dá)均明顯升高。本課題組借助GOBO數(shù)據(jù)庫(kù)分析了 SPIN1在多種乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示SPIN1在三陰性乳腺癌細(xì)胞較Her2陽(yáng)性或激素受體陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)上調(diào)。利用 PPISURV、Kaplan Meier plotter、PrognoScan 在線軟件分析了 SPIN1 表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)SPIN1高表達(dá)的患者相比于SPIN1低表達(dá)患者預(yù)后更差。(2)SPIN1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響實(shí)時(shí)定量PCR顯示,與對(duì)照組相比,SPIN1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可顯著上調(diào)SPIN1的表達(dá),而SPIN1 siRNA轉(zhuǎn)染則顯著地降低了 SPIN1的表達(dá)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染SPIN1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或SPIN1siRNA后,進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,SPIN1能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性及遷移浸潤(rùn)能力,且抑制細(xì)胞凋亡。而SPIN1對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯影響。(3)SPIN1調(diào)節(jié)乳腺癌耐藥及遷移浸潤(rùn)的機(jī)制研究在MCF-7/ADM細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SPIN1 siRNA或陰性對(duì)照之后進(jìn)行差異表達(dá)基因分析,結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,SPIN1siRNA組有4409個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá),其中2413個(gè)為表達(dá)下調(diào),而1996個(gè)為表達(dá)上調(diào)。其中許多差異表達(dá)的基因富集在PI3K/Akt通路中。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR、western blot進(jìn)行驗(yàn)證顯示PI3K/Akt通路中的關(guān)鍵分子PIK3CA、AKT、CREB1及BCL2是SPIN1的下游靶基因。為初步探究PIK3CA、AKT、CREB1及BCL2在乳腺癌耐藥組織及敏感組織中的表達(dá)情況,我們進(jìn)行了免疫組化檢測(cè),結(jié)果顯示,PIK3CA、AKT、CREB1與BCL2在乳腺癌耐藥組織較敏感組織表達(dá)上調(diào)。鑒于SPIN1在乳腺癌耐藥中的重要作用,我們還關(guān)注了與藥物代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的差異表達(dá)基因。選擇了 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的部分成員(ABCA13、ABCB4、ABCC13和ABCC8)以及“藥物代謝-細(xì)胞色素P450”通路中的基因(CYP2B6、CYP2C8、GSTA1、GSTA4、UGT2B11、UGT2B17 和 UGT2B4)進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)時(shí)定量PCR及western blot結(jié)果顯示,SPIN1可正向調(diào)控藥物代謝酶CYP2C8、UGT2B4和UGT2B17以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCB4的表達(dá)。利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)采用生物信息學(xué)分析了SPIN1 下游靶基因與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)PIK3CA、AKT、CREB1、BCL2、CYP2C8、UGT2B4、UGT2B17或ABCB4高表達(dá)的乳腺癌患者相比于低表達(dá)的患者預(yù)后要差。(4)SPIN1異常表達(dá)機(jī)制的初步探索本課題組先前的研究表明,在乳腺癌中,miR-489能夠直接靶向SPIN1,負(fù)向調(diào)控SPIN1的表達(dá),增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞化療敏感性,而一個(gè)編碼基因往往受到多個(gè)miRNA的共同調(diào)控。利用TargetScan、microRNA.org和starBase軟件篩選靶向SPIN1 mRNA的3'-UTR的化療耐藥相關(guān)miRNA。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道我們挑選了 miR-148/152 家族的成員(miR-148a-3p、miR-148b-3p 和miR-152-3p)進(jìn)行驗(yàn)證。熒光素酶實(shí)驗(yàn)及 western blot 證實(shí) SPIN1 是 miR-148a-3p、miR-148b-3p 和miR-152-3p的直接靶基因,受其負(fù)向調(diào)控。miR-148a-3p、miR-148b-3p及miR-152-3p在乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM較敏感細(xì)胞MCF-7中表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞耐藥性實(shí)驗(yàn)表明miR-148a-3p、miR-148b-3p和miR-152-3p能夠降低乳腺癌細(xì)胞的化療耐藥性。利用在線軟件miRpower及MIRUMIR分析了miR-148a/148b/152-3p的預(yù)后價(jià)值,結(jié)果顯示miR-148a/148b/152-3p低表達(dá)患者的預(yù)后不良。(5)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA介導(dǎo)的SPIN1異常表達(dá)在乳腺癌耐藥中的作用及機(jī)制為了探究miRNA介導(dǎo)的SPIN1異常表達(dá)在裸鼠動(dòng)物體內(nèi)對(duì)乳腺腫瘤對(duì)阿霉素耐藥性的影響,將穩(wěn)定表達(dá)抑制SPIN1的miRNA(或其對(duì)照)的MCF-7/ADM細(xì)胞注射到雌性裸鼠的乳腺脂肪墊下。結(jié)果顯示,給予阿霉素后,轉(zhuǎn)染miRNA組(SPIN1-low)的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組(SPIN1-high)。這表明miRNA介導(dǎo)的SPIN1異常表達(dá)在裸鼠體內(nèi)增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性。為了在裸鼠體內(nèi)驗(yàn)證miR-489、miR-148/152-SPIN1-下游靶基因調(diào)控軸,我們?cè)诼闶罅鲶w組織中檢測(cè)了上述分子的表達(dá)情況,并分析了其相關(guān)性。結(jié)果顯示,SPIN1 的表達(dá)與 miR-489、miR-148-3p/148b-3p/152-3p 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。至于SPIN1下游的藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,我們發(fā)現(xiàn)瘤體組織中SPIN1和ABCB4、CYP2C8、UGT2B4 和 UGT2B17 的 mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)。western blot結(jié)果顯示,與SPIN1蛋白低表達(dá)的腫瘤相比,SPIN1蛋白高表達(dá)的腫瘤中ABCB4、CYP2C8、UGT2B4和UGT2B17蛋白表達(dá)水平更高。結(jié)論及意義:SPIN1在乳腺癌耐藥及轉(zhuǎn)移性組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),SPIN1高表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)。SP1N1通過(guò)正向調(diào)控PI3K/Akt通路、藥物代謝酶CYP2C8、UGT2B4和UGT2B17以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCB4,進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性及遷移浸潤(rùn),抑制細(xì)胞凋亡。SPIN1 是 miR-148a-3p、miR-148b-3p 和 miR-152-3p的直接靶基因,受其負(fù)向調(diào)控。本研究首次對(duì)SPIN1在乳腺癌耐藥中的作用及機(jī)制進(jìn)行深入探討,有望為SPIN1成為乳腺癌診療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9
【圖文】：

圖１：邋ＳＰＩＮ１在乳腺癌耐藥組織及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)上調(diào)。（Ａ－Ｅ）乳腺逡逑癌化療耐藥組織較敏感組織ＳＰＩＮ１蛋白高表達(dá)（Ｐ邋＝邋０．０００９），伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組逡逑織較不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織ＳＰＩＮ１蛋白高表達(dá)（Ｐ邋＝邋０．０３３７）。（Ｆ－Ｇ）為了測(cè)試逡逑ＳＰＩＮ１在乳腺癌中作為化療耐藥及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物的能力，建立了邋ＲＯＣ逡逑

在５５例乳腺癌新鮮組織中對(duì)ＳＰＩＮ邋１邋ｍＲＮＡ表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ檢逡逑測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＳＰＩＮ１在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中較不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織逡逑中表達(dá)上調(diào)２．８倍（表２，圖２，Ｐ邋＝邋０．０４３１）。而ＳＰＩＮ１與其它臨床病理參數(shù)如逡逑年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤直徑、臨床分期、激素受體狀態(tài)、ＨＥＲ２、Ｋｉ－６７、ｐ５３逡逑表達(dá)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)；我們推測(cè)這可能有新鮮乳腺癌組織病例數(shù)目較少有關(guān)，ＳＰＩＮ１逡逑在新鮮乳腺癌組織中的表達(dá)情況有待在大樣本中進(jìn)一步探討。逡逑表２．邋ＳＰＩＮ１在新鮮乳腺癌組織中的表達(dá)邐逡逑變量邐樣本數(shù)邐表達(dá)量中位數(shù)邐Ｐ值逡逑年齡（歲）逡逑＜５０邐２４邐０．０００９邐０．１３３２逡逑＞５０邐３１邐０．００２２逡逑組織學(xué)分級(jí)逡逑Ｉ＋ＩＩ邐１９邐０．００４９邐０．３３３５逡逑ＩＩＩ邐１１邐０．００２６逡逑缺失邐２５邐０．０００６逡逑腫瘤直徑逡逑＜３邐３３邐０．００２２邐０．２６１５逡逑＞３邐２１邐０．００１逡逑缺失邐１邐０．０３１７逡逑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移逡逑陰性邐２５邐０．０００９邐０．０４３１逡逑陽(yáng)性邐３０邐０．０

【參考文獻(xiàn)】

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2 岳文,孫麗亞,李春海,張立新,裴雪濤;卵巢癌相關(guān)基因的篩選與鑒定[J];癌癥;2004年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 陳旭;miR-489通過(guò)抑制SPIN1逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療耐藥的研究[D];山東大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2713672