【摘要】：背景肝癌(HCC)是一種沒(méi)有明確臨床病理學(xué)定義的惡性消化系統(tǒng)腫瘤,嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康~([1-3])。HCC的復(fù)發(fā)率和死亡率高,5年生存率不到15%,而在中國(guó)為10.1%~([4])。在HCC患者中,男性多于女性。HCC的治療方法有多種,最常用的有效治療是手術(shù)切除和使用化療藥物如Sorafenib等~([5])。但是,手術(shù)切除對(duì)病人的身體傷害大,一般的化療藥物雖然有助于部分病人的病情,但是對(duì)于晚期HCC患者的治療依然不樂(lè)觀,所以需要尋找更好的和更有效的藥物用于治療HCC。HCC細(xì)胞具有無(wú)限增殖的特性,而蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitors,PIs)可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的周期,阻止其無(wú)限增殖,PIs尤其可以選擇惡性程度高的腫瘤細(xì)胞首先發(fā)揮毒性作用。因此,選擇PIs治療HCC是有希望的。MG132是PIs中的一種,更是一種天然的PIs。并且,已經(jīng)證明MG132能夠?qū)CC細(xì)胞發(fā)揮毒性作用~([6])。MG132對(duì)HCC細(xì)胞的毒性作用涉及多種途徑,如p53、MAPK和AKT,以及多種基因如TRAIL等~([7-9])。但是MG132在治療HCC細(xì)胞中的更加全面的調(diào)控機(jī)制并不是很清楚。為了MG132能夠更早更好的應(yīng)用臨床治療HCC,對(duì)MG132治療HCC的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行更加深入全面的探討是有必要的。SIRT2是一種去乙�；�,與一些E3泛素連接酶具有相互作用。SIRT2參與細(xì)胞的有絲分裂,通過(guò)細(xì)胞周期影響細(xì)胞的增殖。并且,SIRT2在HCC組織和細(xì)胞中高表達(dá),與HCC的惡性程度呈正相關(guān)。有證據(jù)證明,慢病毒介導(dǎo)的SIRT2沉默能夠抑制HCC細(xì)胞的增殖,說(shuō)明SIRT2的下調(diào)將有助于HCC的治療~([10])。但是,在使用MG132治療HCC的過(guò)程中是否能夠引起SIRT2下調(diào),并沒(méi)有研究。因此,為了全面地了解MG132在治療HCC過(guò)程中的功能,在HCC細(xì)胞中展開(kāi)對(duì)MG132和SIRT2的研究是有必要的。目的本研究通過(guò)初步探討MG132在抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡和自噬的調(diào)控機(jī)制,旨在闡明SIRT2在MG132處理SMMC-7721細(xì)胞過(guò)程中的作用。并且通過(guò)對(duì)MG132抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖過(guò)程中機(jī)制的研究,為MG132治療HCC提供更多的理論依據(jù),最終將有助于治療HCC新藥物的開(kāi)發(fā)。方法1.選取HCC細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞做為研究對(duì)象,用MTT檢測(cè)2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM和80μM濃度的MG132培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞24 h的細(xì)胞活力。2.用20μM的MG132培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞24 h,用hoechst33258染色檢測(cè)是否有凋亡小體;western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3的變化;用MDC染色檢測(cè)自噬小體;western blot檢測(cè)自噬蛋白LC3I和LC3II的變化。3.選取20μM MG132培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞6 h、12 h和24 h,用western blot檢測(cè)SIRT2、LC3I、LC3II、ATG7、STAT3和P-STAT3的變化。4.SIRT2轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞。5.20μM MG132培養(yǎng)正常、轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-HA質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染SIRT2-PCDNA3.1-HA質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞株6 h、12 h、18 h和24 h,用MTT檢測(cè)細(xì)胞的抑制率。6.20μM MG132培養(yǎng)轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-HA質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染SIRT2-PCDNA3.1-HA質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞株24 h,用western blot檢測(cè)LC3I和LC3II的變化;用MDC染色比較兩種細(xì)胞自噬程度的差異;用細(xì)胞凋亡流式和hoechst33258染色比較兩種細(xì)胞凋亡程度的差異。結(jié)果1.MTT結(jié)果表明,隨著MG132濃度和時(shí)間的增加SMMC-7721細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制。2.MDC和hoechst33258染色以及western blot結(jié)果看出,使用20μM MG132處理SMMC-7721細(xì)胞24 h,與對(duì)照組相比MG132處理組細(xì)胞出現(xiàn)了的凋亡和自噬特征。3.選擇20μM MG132培養(yǎng)正常SMMC-7721細(xì)胞6 h、12 h和24 h,SIRT2的蛋白表達(dá)水平在12 h和24 h出現(xiàn)了明顯的下調(diào);同時(shí)自噬相關(guān)蛋白ATG7表達(dá)上調(diào)和標(biāo)志性蛋白LC3II表達(dá)上調(diào);同時(shí)檢測(cè)到P-STAT3下調(diào)。4.選擇20μM MG132培養(yǎng)細(xì)胞24 h,MTT檢測(cè)到正常細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-HA質(zhì)粒細(xì)胞株的抑制率高于轉(zhuǎn)染SIRT2-PCDNA3.1-HA質(zhì)粒細(xì)胞株。5.選擇20μM MG132培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞24 h后,western blot、MDC染色、細(xì)胞凋亡流式和hoechst33258染色的結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-HA質(zhì)粒細(xì)胞株和自噬特征比轉(zhuǎn)染SIRT2-PCDNA3.1-HA質(zhì)粒細(xì)胞株凋亡現(xiàn)象更加顯著。結(jié)論1.MG132能夠抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡和自噬。2.MG132通過(guò)下調(diào)SIRT2抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和自噬。
【圖文】：

2 結(jié) 果2.1 MG132 對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞增殖的影響為了觀察 MG132 對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞增殖的影響，我們選取 2.5 μM、5 μM、10 μM20 μM、40 μM 和 80 μM 濃度的 MG132，培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞 24 h，control 組為溶劑對(duì)照組。用酶標(biāo)儀檢測(cè) OD 值，再用 Prim5 軟件繪制細(xì)胞增殖柱狀圖。如圖 2-1，用 2.μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM 和 80 μM 濃度的 MG132 培養(yǎng)的 SMMC-7721 細(xì)胞與 0 μM 組比較活性明顯減低，并且隨著 MG132 濃度的逐漸增大，SMMC-7721 細(xì)胞的增殖抑制作用越明顯。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3，，***P＜0.001，*P<0.05 vcontrol）。

2 結(jié) 果觀察到了細(xì)胞核濃縮、核破裂以及凋亡小體等細(xì)胞凋亡特征。同樣的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)間，直接法收取的 3 種細(xì)胞蛋白，western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 cleaved-caspase3 的達(dá)水平，結(jié)果顯示如圖(2-2-B)，對(duì)照組與藥物處理組均檢測(cè)到了 caspase3，但是與陰和 DMSO 對(duì)照組相比，MG132 的濃度為 20 μM 培養(yǎng)的細(xì)胞收取的蛋白，檢測(cè)到caspase3 的活化條帶 cleaved-caspase3。結(jié)果表明，MG132 能夠誘導(dǎo) SMMC-7721 細(xì)胞亡。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉川;王華芹;高雁艷;林蓓;;MG132聯(lián)合自噬抑制劑對(duì)A2870卵巢癌細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的研究[J];中華腫瘤防治雜志;2013年03期

2 錢(qián)冠華;段昌柱;彭惠民;;蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2012年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張紅;Bortezomib對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡的影響及意義[D];蘇州大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2703904