TN14003對人口腔鱗癌細胞增殖凋亡和侵襲的機制研究

發(fā)布時間：2020-06-08 23:51

【摘要】：口腔癌是對于口腔中惡性腫瘤的統(tǒng)稱,是頭頸部較常見的惡性腫瘤之一,也是世界上惡性程度排名第八的腫瘤。據(jù)報道,中國人口腔癌的發(fā)病率是3.29例/10萬。由于位置的特殊性,一般口腔鱗狀細胞癌在早期不易被人察覺,確診后五年生存率比較低,主要原因在于沒有做到早期發(fā)現(xiàn)、早期預(yù)防,確診時癌細胞已經(jīng)向頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,此類患者即便手術(shù)也很難完全切除,且口腔癌對放化療并不敏感,因此這類患者的預(yù)后往往不容樂觀。為了提高口腔癌患者的治愈率和生存率,我們需要對頭頸部鱗狀細胞癌的侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和抗凋亡機制進行研究。影響腫瘤預(yù)后好壞的一個重要因素是腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是指腫瘤從原發(fā)部位通過血液、淋巴道等途徑遷移到其他部位的過程。趨化因子是指一種使白細胞移行到炎癥部位的一些低分子量的蛋白質(zhì),其能夠與相應(yīng)受體結(jié)合,使腫瘤細胞沿著趨化因子濃度增加的信號向信號源處遷徙,從而調(diào)控腫瘤細胞的遷移和侵襲。CXCR4是一種趨化因子。作為CXCL12的受體,CXCR4是目前腫瘤研究最為廣泛、最具有特征性的趨化因子受體。盡管不同的研究顯示,CXCR4與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān),但是關(guān)于口腔鱗狀細胞癌的研究比較少。因此,CXCR4可能成為腫瘤治療的新一靶點,對于CXCR4陽性的腫瘤組織進行靶向干預(yù)治療可能成為腫瘤的新方法。通過抗體封閉技術(shù)和RNA干擾技術(shù)阻斷CXCR4都能夠抑制腫瘤細胞的侵襲。通過使用趨化因子受體拮抗劑、抑制劑等來下調(diào)趨化因子的表達,從而阻斷趨化因子配體及受體的信號傳導通路,可因此對腫瘤細胞遷移和侵襲、增殖、凋亡等生物學作用產(chǎn)生抑制作用。因此,為了探討CXCL12-CXCR4生物軸在口腔鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移中的作用,我們用熒光定量PCR、免疫組織化學方法、蛋白質(zhì)免疫印跡方法對不同分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗狀細胞癌患者組織中的CXCR4表達進行檢測,并分析CXCR4表達與口腔鱗狀細胞癌臨床病理特征間的關(guān)系。目前,趨化因子和相應(yīng)受體在越來越多的科學研究中被發(fā)現(xiàn),其有能促進腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移的能力�，F(xiàn)在,研究較多的是基質(zhì)衍生因子(stromal derived factor-1,SDF-1,即CXCL12)及其受體CXCR4構(gòu)成的CXCL12/CXCR4生物學軸,已經(jīng)證實CXCL12/CXCR4生物學軸在乳腺癌、惡性黑色素瘤、肉瘤、前列腺癌等惡性腫瘤定向轉(zhuǎn)移、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了主要作用�？谇击[狀癌的浸潤和轉(zhuǎn)移也是涉及多個基因和多種因素的參與和相互作用的結(jié)果。因此,探究人口腔鱗狀癌增殖及轉(zhuǎn)移的分子機制,探索有效治療的靶點,將要成為積極治療口腔鱗狀癌患者有效的重要突破。趨化因子CXCL12即基質(zhì)細胞源性因子衍生因子,深入?yún)⑴c到各種腫瘤細胞的增殖、侵襲等生命過程。CXCR4是CXCL12的受體。CXCR4是高度保守的7次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體,CXCL12-CXCR4生物軸具有重要的生物學功能,涉及到細胞凋亡,周期,遷移等。本研究將探討CXCL12/CXCR4生物學軸在口腔鱗癌中的表達,以及對于口腔鱗癌中的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移中進一步了解CXCL12/CXCR4生物學軸與最強的CXCR4阻斷劑之間的關(guān)系,為口腔鱗癌的治療、預(yù)后等提供新的研究方向。本研究對CXCR4拮抗劑TN14003對CXCL12/CXCR4生物學軸調(diào)控口腔鱗癌細胞生長及浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機制進行了如下實驗研究。研究共分為三個部分:第一部分:我們針對2010-2016年于天津市腫瘤醫(yī)院頭頸科手術(shù)切除及活檢的75例具有完整臨床病例資料的樣本,分析影響口腔鱗癌術(shù)后生存率的相關(guān)因素。通過完整的病理資料的口腔鱗癌標本特點,以正�？谇徽衬そM織及良性腫瘤組織為對照。將口腔鱗狀細胞癌腫瘤組織樣本根據(jù)臨床病理資料分期(I,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ),根據(jù)分化程度分為高分化和低分化兩組,根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組兩組。將腫瘤組織提取總RNA和總蛋白,熒光定量PCR檢測CXCL12和CXCR4的基因表達,western blot方法檢測CXCL12和CXCR4和蛋白表達水平。另外對腫瘤組織和癌旁組織進行固定、包埋、切片,免疫組化方法檢測CXCL12和CXCR4的表達。第二部分:從細胞水平,將人口腔鱗狀癌細胞分為對照組、TN14003高中低濃度組,每個組分設(shè)不同時間組。在特異性拮抗劑TN14003阻斷CXCR4后,MTT實驗和克隆形成實驗檢測細胞的增殖情況,流式細胞術(shù)AnnexinV/PI染色和TUNEL實驗檢測細胞凋亡情況,Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲情況,Western blot實驗檢測CXCL12-CXCR4和相關(guān)信號通路蛋白的表達情況。第三部分:擴增細胞,裸鼠腋下種植構(gòu)建人口腔鱗狀細胞癌的移植瘤模型,將動物分為空白組,對照組和TN14003給藥組。給藥4周后處死動物,檢測腫瘤組織大小。Western blot和免疫組化方法檢測腫瘤組織的CXCR4的表達,以驗證這種作用是否是通過調(diào)控CXCL12-CXCR4的表達來實現(xiàn)的。結(jié)果:對于不同分期的腫瘤樣本組織進行CXCR4基因表達檢測,與I期相比,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ期CXCR4表達顯著升高(P0.05);與Ⅱ期相比,Ⅲ,Ⅳ期CXCR4表達顯著升高(P0.05);與Ⅲ期相比,Ⅳ期CXCR4表達顯著升高(P0.05)。發(fā)生轉(zhuǎn)移和未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織進行CXCR4基因表達檢測,與良性對照組相比,腫瘤組織的CXCR4基因表達顯著升高(P0.05);與發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織相比,未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織CXCR4表達顯著降低(P0.05)。對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移的淋巴組織進行CXCR4基因表達檢測,與未轉(zhuǎn)移組的淋巴組織相比,轉(zhuǎn)移組的淋巴組織的CXCR4基因表達顯著升高(P0.05)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,在TN14003作用24h后高濃度組相對于對照組凋亡率發(fā)生了顯著增加(p0.05),48h和72h后低濃度和高濃度組的細胞增殖相較于48h和72h對照組分別都發(fā)生了顯著增加(p0.05)�？寺⌒纬山Y(jié)果顯示,在TN14003作用24h后,高濃度組相對于對照組發(fā)生了顯著抑制,48h和72h后低濃度和高濃度組的細胞增殖相較于48h和72h對照組分別發(fā)生了顯著抑制(p0.05)。q-PCR和western blot檢測結(jié)果顯示,在TN14003作用24h后,高濃度組相對于對照組CXCR4的基因和蛋白表達顯著降低,48h和72h后低濃度和高濃度組處理的細胞CXCR4基因和蛋白表達與48h和72h對照組分別都發(fā)生了顯著降低(p0.05)。對于CXCL12的表達,各組之間不存在顯著性差異。TN14003處理4周后的裸鼠,口腔鱗癌細胞生長受到顯著抑制。q-PCR western blot檢測結(jié)果顯示,TN14003處理組的裸鼠腫瘤組織中,CXCR4表達相對于對照組和空白組顯著降低(p0.05)。對于CXCL12的表達,各組之間不存在顯著性差異。結(jié)論:1.在口腔鱗癌中,CXCR4與腫瘤分期直接相關(guān),隨著腫瘤分期的提高,CXCR4表達隨之升高。CXCR4與腫瘤轉(zhuǎn)移直接相關(guān),轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中CXCR4表達顯著升高。在發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者淋巴組織中,CXCR4表達顯著升高。2.TN14003處理能夠顯著抑制口腔鱗癌細胞的增殖和侵襲,促進細胞的凋亡。3.TN14003處理能夠在體內(nèi)顯著抑制口腔鱗癌細胞的生長和侵襲。4.TN14003對口腔鱗癌細胞在體內(nèi)、體外的作用是通過抑制CXCR4的表達不是CXCL12表達,同時通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR和GSK3β/βcatenin改變細胞的凋亡和侵襲性而實現(xiàn)。
【圖文】：

熔解曲線,基因表達