【摘要】：目的:盡管近年來篩查和診療技術(shù)的進步,在很大程度上提高了乳腺癌患者的生存率,其仍是女性死亡率最高的的重大疾病之一,其治療結(jié)果存在巨大的個體差異。目前的遺傳預(yù)后預(yù)測方案大都基于基因芯片,在缺乏特異性的同時,可能給患者帶來額外的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此,發(fā)掘更為精準(zhǔn)和經(jīng)濟的新型生物標(biāo)志物進行預(yù)后預(yù)測具有重要的臨床意義。人類驅(qū)動蛋白家族成員4A(kinesin family member 4A,KIF4A)在多種細(xì)胞生理活動進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,如染色體濃聚,細(xì)胞有絲分裂等。近年來,不斷有證據(jù)證實KIF4A在胃癌、肺癌、宮頸癌、肝癌,乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生及進展中起到的重要作用。本研究通過對TCGA和GEO數(shù)據(jù)集進行深入生物信息學(xué)分析,以及通過體外實驗驗證,評估KIF4A的表達與乳腺癌的臨床特征和預(yù)后預(yù)測之間的關(guān)系及其可能miRNA調(diào)控因子的作用機制,探究KIF4A作為潛在的乳腺癌生物標(biāo)志物的預(yù)后預(yù)測價值。方法:第一部分研究從GEO數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫下載具有相應(yīng)臨床和隨訪信息的人乳腺組織基因表達譜數(shù)據(jù)集用于評估KIF4A的表達和乳腺癌臨床特征之間的關(guān)系�；诿總€數(shù)據(jù)集的mRNA表達百分位數(shù)將患者重新分層為四個亞組(Q1,Q2,Q3和Q4),小于中值的表達水平定義為低KIF4A(Q1+Q2),而大于或等于中值的表達水平定義為是高KIF4A(Q3 + Q4)。使用R語言管理基因表達譜數(shù)據(jù)庫,評估KIF4A的表達與乳腺癌預(yù)后之間的關(guān)系。使用GSEA分析研究KIF4A的表達和臨床特征相關(guān)性及生物學(xué)效應(yīng)。第二部分研究選取10種乳腺癌細(xì)胞系,采用RT-PCR及Western-blot的方法檢測KIF4A在乳癌細(xì)胞中的表達情況,選取高表達KIF4A的MDA-MB-231細(xì)胞進行下一步功能實驗。構(gòu)建靶向KIF4A的shRNA及相應(yīng)的陰性對照序列,分別轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞后,采用CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況,以及克隆形成實驗檢測細(xì)胞集落形成能力,同時采用Westem-blot的方法檢測敲低KIF4A之后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。第三部分研究使用TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫中GSE22220數(shù)據(jù)集篩選與乳腺癌中KIF4A表達相關(guān)的miRNA,應(yīng)用miRanda算法預(yù)測可能具有KIF4AmRNA結(jié)合位點的miRNA,兩者取交集得到最有可能參與KIF4A表達調(diào)控的miRNA。利用雙熒光素酶報告基因測定來驗證miR-335與靶基因KIF4A的直接作用。結(jié)果:第一部分研究結(jié)果顯示,KIF4A的mRNA表達水平與腫瘤大小和分級顯著相關(guān),和淋巴轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)。在GSE1456數(shù)據(jù)集中,基底樣乳腺癌中KIF4A的表達明顯更高。對GSE1456數(shù)據(jù)集進行進一步的GSEA分析表明,KIF4A高表達的表型顯著富集了與腫瘤分級高有關(guān)的基因標(biāo)簽,提示KIF4A與乳腺癌易感性、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。對TCGA數(shù)據(jù)集及GEO數(shù)據(jù)集進行生存分析,發(fā)現(xiàn)KIF4A的高表達與總生存(OS)和無進展生存(PFS)低顯著相關(guān)。隨著KIF4A表達的增加,OS和PFS逐漸下降,幾乎呈劑量依賴性。對GEO合并數(shù)據(jù)的進一步分層分析表明,ER陽性和ER陰性亞型中KIF4A表達水平與OS和PFS不佳顯著相關(guān)。這些研究結(jié)果表明,乳腺癌中KIF4A可作為乳腺癌預(yù)后的有力預(yù)測指標(biāo)。第二部分研究進一步在10種乳腺癌細(xì)胞系中明確KIFA4的表達情況并通過體外細(xì)胞系實驗初步探究KIFA4對乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。RT-PCR及Westem-blot均顯示KIF4A在多種乳腺癌細(xì)胞系中高表達,選取MDA-MB-231細(xì)胞來進行Knock-down實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),敲低KIF4A表達后MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的增殖能力及集落形成能力顯著低于對照組,且流式細(xì)胞分析顯示敲低KIF4A mRNA表達后MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞凋亡數(shù)目較對照組明顯增多。為了進一步探索KIFA4調(diào)控乳腺癌凋亡的作用機制,采用Western-blot的方法檢測敲低KIF4A表達之后,細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP以及Cleaved-Caspase-3表達顯著增加。第三部分研究對TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示miR-335的表達與患者生存期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。KIF4A的表達水平與miR-335和miR-411的表達呈負(fù)相關(guān)。利用miRanda算法預(yù)測可能具有KIF4A mRNA結(jié)合位點的miRNA,取兩種篩選miRNA的交集,提示在乳腺癌中miR-335和miR-411可能是KIF4A對應(yīng)的調(diào)控miRNA。通過進一步分層分析,提示乳腺癌PFS預(yù)后情況以表達水平依賴的方式與miR-335的表達相關(guān),而非與miR-411的表達相關(guān),于是選擇miR-335利用雙熒光素酶報告基因測定,表明miR-335通過靶向KIF4A mRNA的3'-UTR來抑制KIF4A表達。結(jié)論:第一部分研究發(fā)現(xiàn)KIF4A表達和乳腺癌大小和分級顯著相關(guān),在基底樣乳腺癌中KIF4A的表達顯著升高。GSEA分析提示KIF4A與乳腺癌易感性、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。進一步生存分析發(fā)現(xiàn)KIF4A的高表達與預(yù)后不良顯著相關(guān),KIF4A可作為乳腺癌預(yù)后的潛在預(yù)測指標(biāo)。第二部分通過體外實驗研究KIF4A在乳腺癌細(xì)胞系中的表達情況及其功能。KIF4A在多種乳腺癌細(xì)胞系中高表達,其中在MDA-MB-231中表達最高。采用shRNA敲低KIF4A的表達,發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力明顯下降,流式細(xì)胞分析顯示敲低KIF4A表達之后,MDA-MB-231細(xì)胞凋亡顯著增加。這提示我們KIF4A通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡從而影響腫瘤進展。第三部分研究根據(jù)GSE22220數(shù)據(jù)集篩選與乳腺癌中KIF4A表達相關(guān)的miRNA,KIF4A的水平與miR-335和miR-411的表達呈負(fù)相關(guān)。提示miR-335和miR-411可能是KIF4A對應(yīng)的調(diào)控miRNA,聯(lián)合TCGA數(shù)據(jù)庫分析根據(jù)miRanda算法,最終發(fā)現(xiàn)了 miR-335是調(diào)控KIF4A的關(guān)鍵miRNA。雙熒光素酶報告基因測定驗證miR-335通過靶向KIF4A mRNA的3'-UTR來抑制KIF4A表達,進而影響乳腺癌PFS預(yù)后情況。
【圖文】：

博士學(xué)位論文邐第一部分結(jié)果逡逑１．２）ＫＩＦ４Ａ逡逑高（％）邐低（％）邐戶值＊＊逡逑＋邐１８２邋（９１．５）邐１７邐（８．５）逡逑邐２７邋（１９．３）邐１１３邐（８０．７）逡逑樣邐９４邋（４７．２）邐１０５邐（５２．８）逡逑化療邐＜０．０００１逡逑６８３邋（４５．３）邐８２５邐（５４．７）逡逑２６９邋（６７．９）邐１２７邐（３２．１）逡逑計學(xué)意義，ｍＰ＜0．0５。逡逑

％邐Ｈａ．逡逑咖ｎＯＵ逡逑圖１．１邋ＫＩＦ４Ａ在乳腺癌組織中的表達情況不同臨床特征的關(guān)系逡逑ＫＩＦ４ＡｍＲＮＡ的表徸水平與腫瘤大小和分級顯著相關(guān)，，但與淋巴結(jié)侵襲無關(guān)逡逑＊＊邋尸邋＜０．０１逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

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本文編號：2696415