【摘要】：對(duì)伊立替康(Irinotecan,CPT-11)、氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)等傳統(tǒng)的結(jié)直腸癌化療藥物產(chǎn)生耐藥性是中晚期結(jié)直腸癌患者治療失敗的主要原因之一。其中,僅有30-35%的患者對(duì)伊立替康的治療方案有效,且5年存活率低于10%。越來越多的研究數(shù)據(jù)證實(shí)腫瘤干細(xì)胞參與腫瘤耐藥性的產(chǎn)生。姜黃素作為一種植物多酚,具有降低結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性的作用,然而其緩解結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥性的作用是否與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)目前仍尚未完全闡明。第一部分:對(duì)伊立替康耐藥的人結(jié)腸癌細(xì)胞株的構(gòu)建、鑒定及姜黃素對(duì)其耐藥性、腫瘤干細(xì)胞特性的影響目的研究人結(jié)腸癌細(xì)胞伊立替康耐藥性的產(chǎn)生與腫瘤干細(xì)胞特性之間的關(guān)系,以及姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞伊立替康耐藥性的影響,并探討其機(jī)制。方法采用藥物持續(xù)接觸濃度遞增法建立對(duì)伊立替康耐藥的人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo/CPT-11細(xì)胞;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)法檢測(cè)其生長抑制率并計(jì)算耐藥指數(shù);RT-PCR和Western blot法檢測(cè)耐藥細(xì)胞的多藥耐藥蛋白ABCB1和腫瘤干細(xì)胞(CSC)標(biāo)志物CD44、CD133、EpCAM、CD24在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化。不同濃度的姜黃素(2.5、5μmol/L)分別聯(lián)合伊立替康作用于耐藥細(xì)胞,檢測(cè)姜黃素對(duì)其耐藥性的影響;RT-PCR和Western blot法檢測(cè)姜黃素和伊立替康對(duì)耐藥細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響。結(jié)果1.LoVo/CPT-11細(xì)胞株能在伊立替康濃度為50μmol/L培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長,LoVo 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為 43.27±1.64μmol/L,LoVo/CPT-11 細(xì)胞的 IC50為 268.72±2.43μmol/L,耐藥指數(shù) RI=6.21。2.耐藥細(xì)胞的多藥耐藥基因ABCB1和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD133、EpCAM和CD24在mRNA 水平和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)都顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.不同濃度的姜黃素(2.5、5μmol/L)分別聯(lián)合伊立替康作用于LoVo/CPT-11細(xì)胞,均可顯著降低LoVo/CPT-11細(xì)胞對(duì)伊立替康的耐藥性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.不同濃度的姜黃素處理后的耐藥細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均顯著下降,并且隨著姜黃素濃度的升高,腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)逐漸下調(diào),而伊立替康各濃度組的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)量與對(duì)照組相比無顯著差異。結(jié)論人結(jié)腸癌細(xì)胞伊立替康耐藥性的產(chǎn)生與結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞特性相關(guān),姜黃素可能通過抑制腫瘤干細(xì)胞特性來降低伊立替康耐藥性。第二部分:姜黃素對(duì)富集的結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞的作用及機(jī)制研究目的探究姜黃素對(duì)結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制。方法采用無血清培養(yǎng)懸浮細(xì)胞球的方法富集結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)比較LoVo細(xì)胞、LoVo/CPT-11細(xì)胞和懸浮細(xì)胞球中的CD133+細(xì)胞比例大小;不同濃度的姜黃素(0,2.5,5,10,20μmol/L)和伊立替康(0,10,20,40,100μmol/L)作用于懸浮細(xì)胞,光鏡下觀察懸浮細(xì)胞成球能力的變化并計(jì)數(shù)各處理組的懸浮細(xì)胞球數(shù);Western blot檢測(cè)姜黃素對(duì)懸浮細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響;通過動(dòng)物荷瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素對(duì)懸浮細(xì)胞成瘤能力的影響;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)姜黃素對(duì)懸浮細(xì)胞凋亡的影響,并采用Western blot法檢測(cè)不同處理下的懸浮細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果1.LoVo/CPT-11細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周能夠形成典型的懸浮細(xì)胞球,懸浮成球細(xì)胞中的CD133+細(xì)胞的比例為63.3%,較LoVo細(xì)胞和LoVo/CPT-11細(xì)胞的1.0%和5.0%顯著增加。2.隨著姜黃素濃度的升高,懸浮細(xì)胞成球的數(shù)目明顯降低,并且當(dāng)姜黃素濃度達(dá)1Oμmol/L以上時(shí)無懸浮細(xì)胞球生成,而伊立替康對(duì)懸浮細(xì)胞成球能力無顯著影響。另外,姜黃素和伊立替康聯(lián)合給藥時(shí)對(duì)懸浮細(xì)胞成球的抑制作用比姜黃素單藥處理時(shí)更顯著。3.與對(duì)照組相比,姜黃素單藥組和混合給藥組中的懸浮細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在蛋白質(zhì)和mRNA水平表達(dá)顯著降低,而伊立替康單藥組的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.未經(jīng)姜黃素處理組的腫瘤體積顯著大于經(jīng)姜黃素處理組的腫瘤體積,表明姜黃素對(duì)結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞成瘤能力呈顯著抑制作用。5.與對(duì)照組相比,姜黃素單藥組和混合給藥組中細(xì)胞凋亡比例增高,抗凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)顯著降低,促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)上升。而伊立替康單藥組中細(xì)胞凋亡比例變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論姜黃素對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性呈抑制作用,這可能與其促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞發(fā)生凋亡相關(guān)。
【圖文】：

學(xué)意義（Ｐ邋＜邋０．０５）。另外與親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在逡逑ｍＲＮＡ和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)同樣也都顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（尸＜逡逑０．０５）。如

逑其對(duì)耐藥細(xì)胞的增殖抑制率分別為２．６７±０．０３％和４．３５±０．２４％，兩者低于５％，，此逡逑濃度姜黃素可視為無毒性作用。如圖２－２所示。逡逑４０－逡逑芑邋■逡逑Ｏ邐Ｔ邋Ｊ邋？逡逑５邋３０－邐＿逡逑ｓ邐N逡逑ｌ２0－逡逑５１°：Ｚ逡逑０邋＾邋＾邐ｉ邐１邐Ｉ邐■邐Ｉ邐■邐ｉ邐＊逡逑０邐１０邐２０邐３０邐４０逡逑Ｃｕｒ邋（｜ｉｍｏｌ／Ｌ）逡逑圖２－２姜黃素對(duì)ＬｏＶｏ／ＣＴＰ－ｌｌ細(xì)胞增殖的影響逡逑不同濃度的姜黃素作用于ＬｏＶｏ／ＣＴＰ－１１細(xì)胞２４ｈ。ＣＣＫ－８法測(cè)得細(xì)胞生長抑制率。每個(gè)條逡逑帶代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊叩＜０．００１。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｃｕｒｃｕｍｉｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｒａｔｅｓ邋ｏｆ邋ＬｏＶｏ／ＣＴＰ－ｌｌ邋ｃｅｌｌｓ．逡逑ＬｏＶｏ／ＣＴＰ－ｌｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｃｕｒｃｕｍｉｎ邋ｆｏｒ邋２４邋ｈ．邋Ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ逡逑ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ邋ｒａｔｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ＣＣＫ－８邋ａｓｓａｙ．邋Ｅａｃｈ邋ｂａｒ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ邋士邋ＳＤ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｈｒｅｅ逡逑ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．邋＊Ｐ＜０．０５，邋＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１．逡逑２．４姜黃素對(duì)耐藥細(xì)胞耐藥性的影響逡逑考慮到高濃度的姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，對(duì)檢測(cè)姜黃素在細(xì)逡逑胞耐藥性方面的影響產(chǎn)生干擾
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.35

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2695411