【摘要】：背景與目的肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在我國惡性腫瘤患者死亡率中排名第二。奧沙利鉑(oxliaplatin,L-OHP)是一類新的鉑類化療藥,通過形成烷化結構使DNA發(fā)生鏈內與鏈間交聯(lián),阻斷細胞DNA復制和轉錄,從而產生細胞毒作用和抗腫瘤活性。近年臨床文獻表明,以L-OHP為主的化療方案對HCC患者有較好的療效,安全性和耐受性高,不良反應輕。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)是由腫瘤細胞周圍的活性因子(如細胞因子)、化學物質(如葡萄糖、氧分子、氫離子)、非惡性細胞(如上皮細胞、間質細胞、內皮細胞、成纖維細胞)、結構成分(如細胞外基質)等構成的局部內環(huán)境。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境涉及腫瘤發(fā)生、轉移及耐藥機制。微環(huán)境化學因素對L-OHP的HCC細胞生物效應究竟有無影響及其機制如何,目前尚缺乏報道。我們針對這一問題開展研究,旨在為改良HCC局部化療方法提供相應的實驗基礎與理論依據(jù)。實驗方法1.選擇SMMC-7721 HCC細胞株,體外培養(yǎng)與分組。將葡萄糖(glucose)、氧(O2)、乳酸(lactic acid)、碳酸氫鹽(bicarbonate)各濃度作為腫瘤微環(huán)境變量因素對培養(yǎng)細胞進行不同組合的處理,其中高糖(high glucose,含4.5 g/L葡萄糖)培養(yǎng)8組:高糖常氧(normoxia,20%O2培養(yǎng))、高糖缺氧(hypoxia,1%O2培養(yǎng))、高糖常氧乳酸酸中毒(培養(yǎng)基加純乳酸至終濃度20 mmol/L,p H 6.7)、高糖缺氧乳酸酸中毒、高糖常氧代謝性堿中毒(培養(yǎng)基加5%碳酸氫鈉溶液,p H 8.0)、高糖缺氧代謝性堿中毒、高糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒(培養(yǎng)基p H調至7.0)、高糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒;低糖(low glucose,含1.0 g/L葡萄糖)培養(yǎng)8組:低糖常氧、低糖缺氧、低糖常氧乳酸酸中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒、低糖常氧代謝性堿中毒、低糖缺氧代謝性堿中毒、低糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒。光鏡下觀察各組細胞形態(tài)與生長狀態(tài)。采用CCK-8法檢測各組細胞0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的OD值;采用流式細胞術檢測細胞周期百分含量;采用Hoechst 33342染色法檢測細胞凋亡數(shù);采用Annexin V-FITC/PI染色法檢測細胞凋亡率;采用Transwell小室、劃痕實驗檢測細胞遷移率。通過上述研究觀察微環(huán)境中不同化學因素對HCC細胞的生物效應。2.選擇對HCC細胞影響顯著的微環(huán)境化學因素作為培養(yǎng)條件,并選取0.625μg/ml、1.250μg/ml、2.500μg/ml、5.000μg/ml、10.000μg/ml、20.000μg/ml、40.000μg/ml、80.000μg/ml和160.000μg/ml 9個不同L-OHP終濃度處理SMMC-7721 HCC細胞24 h、48 h、72 h,采用CCK-8法檢測OD值,觀察該化學性微環(huán)境中L-OHP半數(shù)致死濃度,確定后續(xù)實驗采用的L-OHP濃度。3.應用選定的L-OHP濃度,在觀察到的微環(huán)境中不同化學因素對HCC細胞生物效應影響的基礎上分組處理細胞。光鏡下觀察各組細胞形態(tài)與生長狀態(tài)。采用CCK-8法檢測各組細胞處理后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h的OD值;采用流式細胞術檢測各L-OHP處理組細胞周期百分含量;采用Hoechst 33342染色法檢測各L-OHP處理組凋亡細胞數(shù);采用Annexin V-FITC/PI染色法檢測各L-OHP處理組細胞凋亡率;采用Transwell小室實驗檢測各L-OHP處理組細胞遷移率。通過這些實驗觀察微環(huán)境不同化學因素對L-OHP的HCC細胞生物效應的影響。4.選擇對HCC細胞影響顯著的微環(huán)境因素,并采用選定濃度的L-OHP分組分別處理SMMC-7721株與Bel-7404株HCC細胞,采用Western blot法檢測胞內SET7/9、p53、p65表達,初步探討微環(huán)境不同化學因素影響L-OHP的HCC細胞生物效應的機制。實驗結果1.光鏡下可見,各高糖處理組細胞皆呈三角形貼壁生長;各低糖處理組中,低糖常氧乳酸酸中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒、低糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒組細胞變長,貼壁生長,而低糖常氧、低糖缺氧、低糖常氧代謝性堿中毒、低糖缺氧代謝性堿中毒時細胞于72 h漂浮死亡。2.CCK-8法檢測結果顯示培養(yǎng)的HCC細胞受低糖與缺氧組合影響較為顯著,故選擇低糖缺氧(Control)、低糖缺氧乳酸酸中毒(Lactic acidosis)、低糖缺氧代謝性堿中毒(Metabolic alkalosis)、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒(Lactic acidosis+Metabolic alkalosis)4組進行后續(xù)實驗。流式細胞術檢測、Hoechst 33342染色法檢測、Annexin V-FITC/PI染色法檢測、Transwell小室與劃痕實驗結果分別顯示:與低糖缺氧組(Control)比較,Lactic acidosis組、Lactic acidosis+Metabolic alkalosis組G1期細胞百分含量增加、凋亡數(shù)與凋亡率降低或明顯降低、細胞遷移率明顯增加,Metabolic alkalosis組細胞凋亡數(shù)與凋亡率明顯增加或增加、細胞遷移率降低。3.CCK-8法實驗結果顯示,在低糖與缺氧組合培養(yǎng)條件下,L-OHP處理HCC細胞呈現(xiàn)劑量與時間依賴性增殖抑制效應,其中10μg/ml L-OHP作用48 h HCC細胞增殖抑制率為50%。選取該L-OHP濃度分別處理低糖缺氧(L-OHP)、低糖缺氧乳酸酸中毒(Lactic acidosis+L-OHP)、低糖缺氧代謝性堿中毒(Metabolic alkalosis+L-OHP)、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒(Lactic acidosis+Metabolic alkalosis+L-OHP)4組HCC細胞。細胞培養(yǎng)48 h后,光鏡下可見未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)細胞皺縮變圓,Lactic acidosis+L-OHP組和Lactic acidosis+Metabolic alkalosis+L-OHP組細胞變長貼壁生長,L-OHP組與Metabolic alkalosis+L-OHP組細胞大量死亡、漂浮。CCK-8法檢測結果還顯示與未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)比較,加用L-OHP各組24 h、48 h、72 h OD值均顯著下降;與L-OHP組比較,加用L-OHP的其它3組OD值呈不同程度變化:Metabolic alkalosis+L-OHP組OD值下降,Lactic acidosis+L-OHP組與Lactic acidosis+Metabolic alkalosis+L-OHP組OD值增加、尤其前者。4.流式細胞術檢測顯示,與未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)比較,L-OHP組與Metabolic alkalosis+L-OHP組S期細胞百分含量增加。Hoechst 33342染色法檢測、Annexin V-FITC/PI染色法檢測和Transwell小室實驗檢測結果顯示,與未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)比較,L-OHP組細胞凋亡數(shù)與凋亡率增加,細胞遷移率降低;與L-OHP組比較,Lactic acidosis+L-OHP組細胞凋亡率降低、細胞遷移率增加,而Metabolic alkalosis+L-OHP組細胞凋亡數(shù)與凋亡率增加、細胞遷移率明顯降低。5.Western blot檢測結果顯示,在低糖、缺氧條件下,不同微環(huán)境化學因素組合處理SMMC-7721、Bel-7404兩株細胞,與低糖缺氧組(Control)比較,Lactic acidosis組細胞內SET7/9表達明顯增高,Metabolic alkalosis組SET7/9表達則明顯降低;p65表達未見明顯改變。相同條件聯(lián)合L-OHP分組處理兩株細胞時,與未加用L-OHP的低糖缺氧組(Control)比較,L-OHP組SET7/9表達明顯降低(SMMC-7721細胞)或降低(Bel-7404細胞);與L-OHP組比較,兩株細胞Lactic acidosis+L-OHP組SET7/9表達皆明顯增加,Lactic acidosis+Metabolic alkalosis組都有所增高,而Metabolic alkalosis+L-OHP組SET7/9表達都降低;p65表達也未見明顯變化。上述兩種情況下兩株HCC細胞皆未檢測到p53表達。結論1、本研究所觀察的微環(huán)境化學因素中,低糖與缺氧組合對SMMC-7721細胞增殖抑制效應最明顯。此時,乳酸酸中毒促進HCC細胞增殖、遷移而抑制凋亡,代謝性堿中毒則呈現(xiàn)相反作用。2、在本研究低糖、缺氧條件下,一定濃度L-OHP能抑制HCC細胞增殖、促進細胞凋亡與降低細胞遷移率,這種效應被微環(huán)境中乳酸酸中毒削弱,但代謝性堿中毒有協(xié)同作用。3、在本研究低糖、缺氧條件下,一定濃度L-OHP在抑制HCC細胞增殖與遷移的同時會使胞內SET7/9表達下調,這種效應受微環(huán)境中代謝性堿中毒加強,卻受乳酸酸中毒明顯逆轉。提示蛋白賴氨酸甲基轉移酶SET7/9介導的胞內信號通路與L-OHP抗HCC細胞效應機制相關,值得進一步研究證實。
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第二章 實驗結果缺氧、低糖常氧乳酸酸中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒、低糖常氧代謝性堿中毒、低糖缺氧代謝性堿中毒、低糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒（表一和表二）。光鏡下可見，各高糖處理組細胞皆呈三角形貼壁生長；在低糖處理 72 h時，低糖常氧乳酸酸中毒組、低糖缺氧乳酸酸中毒組、低糖常氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒組、低糖缺氧乳酸酸中毒代謝性堿中毒組細胞變長，貼壁生長，，而低糖常氧、低糖缺氧、低糖常氧代謝性堿中毒、低糖缺氧代謝性堿中毒組時細胞于培養(yǎng) 72 h后細胞形態(tài)變圓，呈現(xiàn)大面積漂浮死亡現(xiàn)象（圖 2-1）。可見葡萄糖含量對細胞生長狀態(tài)起決定作用，低糖狀態(tài)下，乳酸酸中毒促進 HCC 細胞生長，代謝性堿中毒則抑制 HCC 細胞存活、生長。

細胞增殖抑制效應最為明顯（圖 2-2）。在觀察范圍內，微環(huán)境無論常氧或缺氧，也無論乳酸酸中毒或代謝性堿中毒，高糖環(huán)境都能維持 HCC 細胞生長，雖然缺氧或缺氧合并乳酸酸中毒時癌細胞增殖能力不及常氧時（圖 2-2 a-d）。低糖狀態(tài)下，無論常氧或缺氧，與高糖培養(yǎng)（圖 2-2 a）相比，96 h~120 h時細胞增殖顯著受抑（圖 2-2 e）；但如果合并乳酸酸中毒，細胞卻能繼續(xù)增殖，雖然增幅不及高糖合并乳酸酸中毒，也呈現(xiàn)缺氧時細胞增殖受抑比常氧時明顯（圖 2-2 f）；如果合并代謝性堿中毒，細胞 48 h 后也出現(xiàn)細胞增殖受抑，與未合并代謝性堿中毒（圖 2-2 e）比較，細胞增殖受抑情況明顯提前，以合并缺氧時受抑效應更顯著（圖 2-2 g）；如果同時合并乳酸酸中毒與代謝性堿中毒（圖 2-2 h），可見細胞增殖受抑效應變小，其變化類似合并乳酸酸中毒者，缺氧時細胞增殖受抑明顯高于常氧時。這些結果多數(shù)同樣提示葡萄糖對 HCC 生長起關鍵作用，乳酸酸中毒能增加細胞對微環(huán)境中葡萄糖缺乏的耐受性，而代謝性堿中毒則降低了細胞對葡萄糖缺乏的耐受性。
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：2695361