發(fā)布時(shí)間：2020-06-03 00:53

【摘要】：目的:胃癌發(fā)病因素很多,本課題通過調(diào)查胃癌病人血清中抗幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(Cytotoxin associated gene A,Cag A)抗體的產(chǎn)生情況,檢測胃癌組織中結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer1,MACC1)的表達(dá),同時(shí)分析胃癌患者IL-17A+/IFN-γ+CD3+T(CD4、CD8、γδT)Th17細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子(IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γ)及其轉(zhuǎn)錄因子(RORγt、T-bet)的表達(dá)水平,探討:胃癌病人血清中抗Cag A抗體的產(chǎn)生和分布情況;MACC1與胃癌的關(guān)系及臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;IL-17A+/IFN-γ+CD3+T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子與胃癌的關(guān)系及臨床病理參數(shù)的關(guān)系;并初步探討其可能的作用機(jī)制。方法:1)所有胃癌患者與健康人群對(duì)照組外周血標(biāo)本或手術(shù)標(biāo)本均來自蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院,所有胃癌患者均記錄性別、年齡及術(shù)后臨床病理分期資料;2)通過構(gòu)建幽門螺桿菌Cag A蛋白的原核表達(dá)載體,獲得Cag A蛋白,通過ELISA方法檢測胃癌患者血清中抗Cag A抗體的產(chǎn)生情況;3)采用RT-PCR檢測胃癌患者癌組織和癌旁組織中MACC1 m RNA的表達(dá)情況,同時(shí)利用免疫組化技術(shù)分析MACC1在胃癌組織中的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;4)分離健康人群對(duì)照組和胃癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)(1×106/cells),應(yīng)用PMA(50ng/ml)+Ionomycin(1μg/ml)+Monensin(500ng/ml)刺激培養(yǎng)5h,采用多色流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse flow cytometer)分別檢測IL-17A+/IFN-γ+CD3+T(CD4、CD8、γδT)細(xì)胞頻數(shù);5)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)技術(shù),檢測外周血PBMC中IL-17A+T細(xì)胞主要轉(zhuǎn)錄因子RORγt,IFN-γ+T細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子T-bet及IL-17A+/IFN-γ+T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γm RNA的表達(dá)水平;6)采用液相芯片技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測胃癌患者和健康人群對(duì)照組血清IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γ濃度;7)采用SPSS19.0軟件對(duì)胃癌組織與癌旁組織MACC1 m RNA表達(dá)水平,IL-17A+/IFN-γ+CD3+T細(xì)胞的頻數(shù)及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平、胃癌患者臨床病理分期等資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1)表達(dá)制備高純度的Cag A融合蛋白,利用間接ELISA法,調(diào)查發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中Cag A抗體的陽性率高達(dá)83.3%,且與患者的年齡、性別和腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理分期等無顯著性差異,同時(shí)發(fā)現(xiàn)正常健康體檢者的Cag A抗體陽性率僅為5%。2)MACC1 m RNA在胃癌組織中陽性率為70%,顯著高于癌旁組織,MACC1 m RNA表達(dá)與胃癌浸潤深度、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關(guān),而與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)。并且免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MACC1蛋白在胃癌組織中高表達(dá),而在癌旁組織中基本不表達(dá)。3)與健康人群對(duì)照組比較,胃癌患者組外周血中Th17、γδT17細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞中的頻數(shù)顯著升高,Tc17細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞中的頻數(shù)顯著降低,且Th17細(xì)胞頻數(shù)與Tc17細(xì)胞頻數(shù)呈負(fù)相關(guān);IFN-γ+CD3+CD4+Th1細(xì)胞、IFN-γ+CD3+CD8+T細(xì)胞及IFN-γ+CD3+γδT細(xì)胞在胃癌患者外周血CD3+T細(xì)胞中的比例均顯著低于健康體檢組;4)在外周血Th17、Tc17、IFN-γ+CD3+CD4+T、IFN-γ+CD3+CD8+T細(xì)胞的比例與腫瘤的浸潤深度(T1+T2/T3+T4)、腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0/M1)分別存在顯著差異;Tc17、γδT17、IFN-γ+CD3+CD8+T及IFN-γ+CD3+γδT細(xì)胞在TNM分期(I+II/III+IV)中均存在顯著差異;γδT17、IFN-γ+CD3+γδT細(xì)胞與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0/N1+N2+N3)存在顯著差異;5)細(xì)胞內(nèi)IL-17A因子在外周血CD3+T細(xì)胞中的來源主要為Th17細(xì)胞,其次為Tc17細(xì)胞,而γδT17細(xì)胞所占比例最少;而細(xì)胞內(nèi)IFN-γ+因子在外周血CD3+T細(xì)胞中的來源主要為CD8+T細(xì)胞,其次為CD4+Th1細(xì)胞,而γδT細(xì)胞所占比例最少;6)胃癌患者血清IL-17A、IL-23、IL-1β的濃度顯著高于健康人群對(duì)照組,而IFN-γ的濃度顯著低于健康人群對(duì)照組;且IL-17A、IL-23、IL-1β及IFN-γ在腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0/N1+N2+N3)和TNM分期(I+II/III+IV)中均存在顯著差異;IL-23、IL-1β、IFN-γ濃度在腫瘤的浸潤深度(T1+T2/T3+T4)中分別存在顯著差異;IL-1β濃度在腫瘤的分化程度(高-中分化/低分化)也存在一定的差異;此外在胃癌患者中血清IL-17A的濃度與Th17細(xì)胞的頻數(shù)密切相關(guān)(r=0.3310,p=0.0231);7)IL-17A+CD3+T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的RORγt m RNA在胃癌患者中的表達(dá)水平顯著高于健康人群對(duì)照組;而IFN-γ+CD3+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子T-bet m RNA表達(dá)水平顯著低于健康人群對(duì)照組(P0.05);結(jié)論:1)我國胃癌患者大多數(shù)與感染Cag A陽性的幽門螺桿菌有關(guān),血清中Cag A抗體的檢測有望成為胃癌高危因素的參考指標(biāo);2)MACC1表達(dá)與胃癌的浸潤深度、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TNM分期呈正相關(guān),有望成為胃癌診療的一個(gè)新指標(biāo);3)胃癌患者外周血CD3+T細(xì)胞中,Th17和γδT17細(xì)胞呈高表達(dá),Tc17細(xì)胞呈低表達(dá),且細(xì)胞內(nèi)IL-17A的來源主要為Th17細(xì)胞,這些IL-17A+CD3+T細(xì)胞與腫瘤的病理特征存在相關(guān)性;4)胃癌患者外周血CD3+T細(xì)胞中,IFN-γ+CD3+CD4+Th1細(xì)胞、IFN-γ+CD3+CD8+T細(xì)胞及IFN-γ+CD3+γδT細(xì)胞呈低表達(dá),且細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的來源主要為CD3+CD8+T細(xì)胞,這些IFN-γ+CD3+T細(xì)胞與腫瘤的病理特征存在相關(guān)性;5)胃癌患者血清IL-17A、IL-23、IL-1β的濃度和m RNA表達(dá)水平及轉(zhuǎn)錄因子(RORγt)m RNA表達(dá)水平均顯著高于健康人群對(duì)照組;血清IFN-γ的濃度和轉(zhuǎn)錄因子(T-bet)m RNA表達(dá)水平均低于健康人群對(duì)照組,且與腫瘤的病理特征存在相關(guān)性。
【圖文】：

增cagA基因片段；泳道2： 標(biāo)準(zhǔn)DNA2 cagA基因PCR擴(kuò)增結(jié)建及鑒定 將cagA亞克隆隆經(jīng)酶切及PCR鑒定，目的 和 850bp 左右，證實(shí)表達(dá)

2. 重組質(zhì)粒pet28a/cagA的構(gòu)建及鑒定 將cagA亞克隆到原核表達(dá)載體pet28a多克隆位點(diǎn)中(Nco I和Sal I)，重組克隆經(jīng)酶切及PCR鑒定，目的片段大小與預(yù)期相符，，陽性克隆酶切條帶分別為3000bp 和 850bp 左右，證實(shí)表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖3）。泳道1：標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker (DL2000)；泳道2： 陽性質(zhì)粒雙酶切；泳道3： PCR鑒定圖3 重組質(zhì)粒pet28a/cagA的鑒定2.3 測序結(jié)果及分析 克隆出的目的基因測序顯示，其編碼區(qū)為852bp，編碼284個(gè)氨基酸殘基，部分測序結(jié)果見圖4。與GeneBank已收錄的CagA蛋白編碼基因序列比較，同源性達(dá)100%。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2694037