【摘要】：光動力治療是目前用于治療各種惡性疾病的極具前景的方法之一,具有非侵入性、低毒性等特點。光敏劑作為光動力治療的基本要素之一,開發(fā)高效的新型光敏劑成為當前研究的熱點。碳材料能產(chǎn)生活性氧(ROS),例如眾多科研工作者發(fā)現(xiàn)富勒烯具有顯著的光敏特性。因此,碳材料有望應(yīng)用于光動力治療,從而拓展其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用。與富勒烯具有部分相似結(jié)構(gòu)的碗烯(Cor),是一種性能獨特的曲面多環(huán)芳烴,具有碗狀的空間結(jié)構(gòu),這種三維拓撲結(jié)構(gòu)賦予碗烯偶極和特殊的電子分布等理化性質(zhì)。碗烯在紫外光照射下可以誘導產(chǎn)生I型活性氧,即過氧化氫,羥基自由基和超氧陰離子。碗烯的內(nèi)側(cè)碗底帶負電,外側(cè)邊緣帶正電,即核和外圍之間的電子密度不同,從而具有一定的偶極矩(2.2 D)。這種電荷分布不均勻?qū)е碌碾娮与x域效應(yīng)可以促使電子轉(zhuǎn)移的發(fā)生,從而在光照下誘導產(chǎn)生ROS。碗烯的水溶性極差,這大大限制了碗烯在生物領(lǐng)域的應(yīng)用,因此需要適宜的載體來增加水溶性。本課題組設(shè)計了兩種方式修飾碗烯以增強其水溶性:合成聚乙二醇(mPEG)共價修飾的碗烯衍生物(mPEG-Cor),碗烯的強疏水特性和分子間π-π堆積作用促進其在水中組裝成高載藥量的納米膠束體系;選用環(huán)糊精(CD)對碗烯進行包合,制備了可溶于水的γ-環(huán)糊精/碗烯包合物(γ-CD/Cor)。由于大部分ROS的半衰期很短,擴散距離有限,推測不同載體修飾的碗烯可能導致碗烯誘導產(chǎn)生ROS的差異。作為光敏劑的碗烯,因為曲面結(jié)構(gòu),電荷分布不均,內(nèi)側(cè)帶負電外側(cè)帶正電,具有一定的偶極矩,因此推測碗烯可以靶向具有很高負膜電位(150-180 mV)的線粒體。因此,本課題通過比較不同載體修飾后的兩種水溶性碗烯在體外誘導產(chǎn)生的ROS,研究碗烯經(jīng)過不同載體修飾后誘導產(chǎn)生ROS能力的差異,證明了在體外γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor碗烯衍生物誘導產(chǎn)生ROS的能力更強,說明了不同的修飾方式影響了碗烯誘導產(chǎn)生ROS的能力;利用紅色熒光染料來標記碗烯,研究了碗烯靶向線粒體的能力及其細胞內(nèi)的分布,證明了碗烯的偶極和電子離域效應(yīng)有利于促進碗烯在線粒體的積聚,提高了光動力學效果。根據(jù)本實驗室已有的方法,制備了不同載體修飾后的兩種水溶性碗烯,即γ-CD/Cor包合物和mPEG-Cor膠束,并比較兩者的理化性質(zhì)。在紫外可見光譜中,mPEG-Cor的兩個紫外最大吸收峰與γ-CD/Cor的相比,都發(fā)生了大致相同的紅移,這是因為具有大π鍵的碗烯連接上帶有炔鍵的PEG后,共軛作用增強,促使紫外光譜整體紅移;利用高效液相色譜法的方法測定了碗烯在兩種載體中的載藥量,mPEG-Cor膠束中碗烯的載藥量為19.1%(w/w),遠高于碗烯在γ-CD/Cor包合物的載藥量8.8%(w/w);使用馬爾文粒度儀和透射電子顯微鏡對二者的粒徑和形貌進行考察,在水中mPEG-Cor自組裝形成了納米尺寸的球狀膠束,γ-CD/Cor包合物以單體形式和聚集狀態(tài)存在,雖然包合物的平均粒徑大于膠束的平均粒徑,但二者的粒徑仍在納米粒子的范圍之內(nèi);不同濃度的磷酸鹽緩沖液中二者的粒徑變化反映其穩(wěn)定性,兩種水溶性碗烯粒徑都隨著磷酸鹽緩沖液濃度的增大而增大,均顯示對磷酸鹽緩沖液離子強度的依賴性聚集。首先在溶液中比較了不同載體修飾后的兩種水溶性碗烯誘導產(chǎn)生ROS的差異。利用活性氧熒光探針DCFH-DA來檢測體外ROS產(chǎn)量,隨著碗烯濃度的增加和光照時間的延長,兩種水溶性碗烯誘導產(chǎn)生的ROS均不斷增加。在相同的碗烯濃度和照射條件下,與mPEG-Cor膠束相比,γ-CD/Cor包合物明顯產(chǎn)生更多的ROS。這可能由于疏水性碗烯位于膠束的內(nèi)核中,光照時誘導產(chǎn)生的ROS因為壽命很短,并且擴散距離有限,表觀的ROS產(chǎn)量受膠束屏障的限制,而在包合物中無這種限制屏障,因此表現(xiàn)為γ-CD/Cor產(chǎn)生ROS的能力更強,說明Cor產(chǎn)生ROS的能力受修飾的載體影響。為了分析兩種水溶性碗烯誘導產(chǎn)生的活性氧種類是否有差異,采用了熒光分析和電子自旋共振光譜法進行檢測。利用超氧陰離子熒光探針DHE檢測到了二者光照后產(chǎn)生的超氧陰離子,并且γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor膠束誘導產(chǎn)生的超氧陰離子更多;通過使用標準的過氧化氫檢測試劑盒,驗證了光照后二者均產(chǎn)生了H_2O_2,但產(chǎn)量差異不明顯;由于沒有檢測羥基自由基的穩(wěn)定并且敏感的商業(yè)探針,因此將5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)作為羥基自由基的捕獲劑,采用電子自旋共振儀記錄反應(yīng)后的捕獲劑(DMPO-OH)的特征波譜,證明了二者在光照下產(chǎn)生羥基自由基的能力,并且γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor膠束誘導產(chǎn)生的羥基自由基更多。因此,無論載體種類如何,修飾后的碗烯在光照下都能誘導產(chǎn)生超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基,但是γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor膠束誘導產(chǎn)生的ROS總量更多。選用人的前列腺癌細胞(PC-3),在細胞水平上探究了不同載體修飾后的兩種水溶性碗烯誘導產(chǎn)生ROS能力的差異。首先測定兩種水溶性碗烯在細胞攝取量的差異,將碗烯當量相同的γ-CD/Cor包合物和mPEG-Cor膠束與細胞共孵育3小時,采用高效液相色譜法,檢測二者在細胞內(nèi)的攝取程度,計算得包合物和膠束的細胞攝取率分別為4.8±0.8%(w/w)和5.5±0.5%(w/w),膠束比包合物進入細胞內(nèi)的碗烯略多,但兩者之間沒有顯著性差異,因此該因素不會顯著影響細胞水平上的光動力學療效。兩種水溶性碗烯與細胞共孵育3小時后,利用細胞滲透性活性氧熒光探針DCFH-DA檢測經(jīng)光照后碗烯在細胞內(nèi)誘導產(chǎn)生的ROS含量,并通過激光掃描共聚焦顯微鏡記錄探針的熒光。結(jié)果顯示,在碗烯當量相同情況下處理的細胞,無光照時沒有明顯地產(chǎn)生ROS;在相同的光照處理后,細胞內(nèi)ROS均顯著增多,但γ-CD/Cor處理的細胞比mPEG-Cor處理的細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)量更多。兩種水溶性碗烯在細胞內(nèi)產(chǎn)生超氧陰離子的能力,采用超氧陰離子熒光探針DHE檢測,檢測結(jié)果與上述結(jié)果相同,γ-CD/Cor產(chǎn)生超氧陰離子的能力更強。不經(jīng)碗烯處理的對照組細胞,光照前和光照后都無明顯的ROS產(chǎn)生。根據(jù)文獻已知碗烯光照后能夠引起線粒體內(nèi)ROS含量的上升,證明了碗烯在線粒體中的積累。本課題采用檢測線粒體內(nèi)ROS的熒光探針MitoSOX Red,檢測兩種水溶性碗烯在線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ROS,結(jié)果表明與mPEG-Cor相比,γ-CD/Cor在線粒體中產(chǎn)生的ROS更多。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能由于PEG的屏蔽作用,只有mPEG-Cor的游離形式才能被線粒體內(nèi)化,相比之下,γ-CD/Cor包合物沒有這種限制,因此線粒體對碗烯的吸收程度與載體類型有關(guān),γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor膠束能更有效地被線粒體攝取。通過標準的細胞毒性試驗檢測PC-3細胞存活率,探究了不同載體修飾后的兩種水溶性碗烯光動力治療的療效差異。將不同濃度的兩種水溶性碗烯與細胞共孵育3小時,再進行不同時間的光照,24小時后檢測細胞存活率。兩種水溶性碗烯在沒有光的情況下都不會誘導顯著的細胞毒性,即暗毒性低。在5分鐘、10分鐘、15分鐘的光照下,γ-CD/Cor包合物的最大半數(shù)抑制濃度(IC_(50))分別為35.2±5.0μM,14.8±2.3μM和9.2±4.7μM。相比之下,mPEG-Cor膠束在的光照10分鐘和15分鐘時的IC_(50)分別為52.9±8.6μM和22.5±2.6μM。這表明在碗烯濃度相等、光照條件相同條件下,γ-CD/Cor包合物可以誘導更高程度的細胞毒性,療效更令人滿意。作為對照,為了測試光照是否影響細胞對碗烯的敏感性,在相同條件下,首先對細胞進行5分鐘、10分鐘、15分鐘的光照再加入兩種碗烯,24小時后檢測細胞毒性,結(jié)果表明相同濃度的碗烯并不會因為光照時間的不同誘導產(chǎn)生顯著不同的細胞毒性,因此光照不會影響細胞對碗烯的敏感性。這兩種水溶性碗烯的光毒性都是由碗烯在光照下誘導產(chǎn)生的ROS導致的,雖然環(huán)糊精包合和聚乙二醇化都可以增加碗烯的水溶性,但是在細胞水平上γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor膠束能有效地產(chǎn)生ROS,這種差異是一方面是由于兩種水溶性碗烯在細胞內(nèi)誘導產(chǎn)生的活性氧總量不同,另一方面是因為γ-CD/Cor能夠?qū)⒏嗟耐胂┹斔偷骄�粒體,在線粒體中產(chǎn)生更多的ROS,這兩方面相結(jié)合,γ-CD/Cor包合物比mPEG-Cor膠束產(chǎn)生更理想的光動力抗癌作用。為了檢測碗烯靶向線粒體的能力,將在紫外區(qū)有弱熒光的碗烯連上一個紅色熒光染料,采用深紅色的線粒體熒光探針定位線粒體,在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察兩者的共定位情況,并且通過計算皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Rr)來實現(xiàn)共定位的定量分析。將帶熒光的碗烯與細胞共孵育2小時、4小時、6小時,發(fā)現(xiàn)隨著孵育時間的增長,碗烯與線粒體的共定位變?nèi)?并且碗烯在除了線粒體之外的其他細胞器中也有分布。這可能是碗烯在與細胞孵育的過程中源源不斷地進入細胞導致的。因此將碗烯和細胞孵育2小時后清洗除去細胞外的碗烯,給予碗烯在細胞中自由分布的時間(1小時、2小時、4小時),結(jié)果顯示隨著分布時間的增長,碗烯和線粒體的共定位程度逐漸增強,但是碗烯在細胞內(nèi)其他細胞器中仍有分布。為了驗證碗烯的偶極矩是否增強了碗烯在線粒體中的積累,將與碗烯結(jié)構(gòu)非常相似的平面分子傒連接同樣的熒光染料作為對照,同樣條件下和線粒體進行共定位實驗,實驗結(jié)果證明,與平面分子傒相比,碗烯與線粒體的共定位程度明顯更高,說明了碗烯的偶極矩確實有利于促進碗烯在線粒體中的積累,但是碗烯靶向線粒體的能力比較弱。為了探究碗烯在細胞中的分布,將帶熒光的碗烯與溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體主要的細胞器進行共定位實驗,發(fā)現(xiàn)在這些主要的細胞器中碗烯都有分布,而且碗烯與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位程度遠大于其他細胞器,但機制需要進一步探究。本課題通過比較不同載體修飾后的兩種水溶性碗烯(γ-環(huán)糊精/碗烯包合物和聚乙二醇共價修飾的碗烯衍生物)產(chǎn)生ROS的差異,證明了在體外條件下環(huán)糊精包合的碗烯比聚乙二醇共價修飾的碗烯誘導產(chǎn)生ROS的能力更強,說明了不同的修飾方式影響碗烯誘導產(chǎn)生ROS的能力,突出了載體在實現(xiàn)碗烯可控釋放活性氧的重要性,為光敏劑載體的選擇提供思路;本課題也探究了碗烯對細胞器的靶向性及細胞內(nèi)的分布,碗烯進入細胞后在線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體主要細胞器中都有分布,由于曲面碗烯的偶極和電子離域作用,促使碗烯在負膜電位高的線粒體中更易積累,增強了碗烯的光動力學效果。
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O613.71;R73-36

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