【摘要】：目的:構(gòu)建過表達IP10的肝癌細胞株及過表達IP10的人臍靜脈內(nèi)皮細胞株,研究IP10對肝癌細胞行為學(xué)的影響及對腫瘤微環(huán)境的影響,并在小鼠體內(nèi)實驗中進一步驗證IP10對肝癌的影響。方法:(1)采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,將過表達IP10的慢病毒及空載慢病毒分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞株SK-hep1及人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC,嘌呤霉素進行篩選以獲得穩(wěn)定表達IP10的細胞株。(2)采用實時熒光定量PCR以驗證IP10在轉(zhuǎn)錄水平上的表達,Western-blot法檢測其在翻譯水平上的表達,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IP10的濃度。(3)采用CCK8檢測IP10對肝癌細胞株SK-hep1增殖的影響,粘附性實驗檢測IP10對肝癌細胞株SK-hep1同質(zhì)粘附及異質(zhì)粘附的影響,Transwell法檢測IP10對肝癌細胞株SK-hep1遷移、侵襲的影響。(4)采用CCK8檢測IP10對人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC增殖的影響,流式法檢測IP10對人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC周期的影響,Transwell法檢測過表達IP10的肝癌細胞培養(yǎng)上清對T淋巴細胞的趨化作用。(5)構(gòu)建小鼠皮下肝癌模型,到腫瘤生長達到約8mm時,瘤內(nèi)分別注射PBS、空載慢病毒、過表達IP10慢病毒。觀察腫瘤體積變化,及采用免疫組織化學(xué)法檢測IP10、血小板-內(nèi)皮細胞粘附分子CD31、M1型巨噬細胞中的特異性表面抗原CD86、T細胞表面標志物CD3的表達情況并采用流式檢測法進一步檢測腫瘤T淋巴細胞浸潤情況。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達IP10的肝癌細胞株及人臍靜脈內(nèi)皮細胞株,通過嘌呤霉素篩選后在熒光顯微鏡下觀察,細胞100%帶綠色熒光。(2)實時熒光定量PCR及Western-blot檢測顯示SK-hep1-IP10及HUVEC-IP10細胞株中的IP10在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均較轉(zhuǎn)染空載慢病毒和野生株高,此外,IP10能分泌到細胞培養(yǎng)基上清中。(3)CCK8檢測細胞增殖實驗結(jié)果顯示IP10基因的過表達并不影響肝癌細胞株SK-hep1的增殖,細胞粘附實驗顯示,過表達IP10的細胞株較轉(zhuǎn)染空載慢病毒的細胞株及野生株的同質(zhì)粘附能力增強,而異質(zhì)粘附能力減弱,Transwell檢測細胞遷移、侵襲能力,結(jié)果顯示IP10基因的過表達并不影響肝癌細胞株SK-hep1的遷移及侵襲。(4)CCK8細胞增殖實驗結(jié)果顯示過表達IP10的人臍靜脈細胞株HUVEC的增殖能力較轉(zhuǎn)染空載慢病毒的細胞株及野生株的低,即IP10能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖,細胞周期結(jié)果顯示細胞增長抑制在S期,Transwell檢測T淋巴細胞趨化實驗結(jié)果顯示培養(yǎng)SK-hep1-IP10細胞株的細胞上清液對T細胞的趨化較空載組及野生組的多,即IP10可趨化T淋巴細胞的浸潤。(5)成功構(gòu)建小鼠肝癌模型,三組小鼠的腫瘤體積比較發(fā)現(xiàn),注射過表達IP10慢病毒組的小鼠皮下腫瘤體積逐漸減小。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,注射過表達IP10慢病毒組中,腫瘤組織中的IP10、CD3的表達較其余兩組增高,CD31較其余兩組降低,而CD86變化不明顯,流式檢測腫瘤組織中淋巴細胞浸潤情況,結(jié)果顯示注射過表達IP10慢病毒組中CD4~+淋巴細胞及CD8~+的淋巴細胞均較對照組高。結(jié)論:(1)IP10是一個分泌蛋白,在SK-hep1-IP10及HUVEC-IP10兩株細胞培養(yǎng)上清中均能檢測到。(2)IP10可影響肝癌細胞的粘附性,但對肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等作用不明顯。(3)IP10可影響腫瘤微環(huán)境,在體內(nèi)實驗中促進淋巴細胞的趨化、抑制新生血管的生成。
【圖文】：

圖 1-1 慢病毒轉(zhuǎn)染細胞系的構(gòu)建對照慢病毒后 SK-hep1 細胞熒光下圖像(×100);B:轉(zhuǎn)染空載對照慢病毒后 SK-100);C:轉(zhuǎn)染過表達慢病毒 LV-IP10 后 SK-hep1 細胞熒光下圖像(×100);D:轉(zhuǎn)染后 SK-hep1 細胞白光下圖像(×100)。Figuer 1-1 Construction of lentivirus-transfected cell linence image of SK-Hep1 cells transfected with lentivirus LV5 (×100); B: White lells transfected with lentivirus LV5(×100); C: Fluorescence image of SKwith overexpressing lentivirus LV-IP10(×100);D: White light image of SKith overexpressing lentivirus LV-IP10(×100).含濃度為 2.5μg/mL 的嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行篩選，，顯微鏡下可見表達綠色熒光蛋白的細胞占總細胞數(shù)的明成功構(gòu)建細胞系。

1-2 1%瓊脂糖凝膠檢測細胞中提取的總 RNA的總 RNA;2:SK-hep1-LV5 細胞株提取的總 RNAe quality of total RNA was detect by 1% agarose g-Hep1 cell line; 2: RNA extracted fromSK-Hep1-ne.提取的總 RNA 在 1%瓊脂糖凝膠中8S、18S、5S。其中 5S 條帶亮度最 18S 條帶亮度的兩倍。瓊脂糖凝膠電實驗需要。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

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本文編號：2684328