【摘要】：目的:構(gòu)建過(guò)表達(dá)IP10的肝癌細(xì)胞株及過(guò)表達(dá)IP10的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株,研究IP10對(duì)肝癌細(xì)胞行為學(xué)的影響及對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響,并在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證IP10對(duì)肝癌的影響。方法:(1)采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,將過(guò)表達(dá)IP10的慢病毒及空載慢病毒分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株SK-hep1及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC,嘌呤霉素進(jìn)行篩選以獲得穩(wěn)定表達(dá)IP10的細(xì)胞株。(2)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR以驗(yàn)證IP10在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá),Western-blot法檢測(cè)其在翻譯水平上的表達(dá),ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IP10的濃度。(3)采用CCK8檢測(cè)IP10對(duì)肝癌細(xì)胞株SK-hep1增殖的影響,粘附性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IP10對(duì)肝癌細(xì)胞株SK-hep1同質(zhì)粘附及異質(zhì)粘附的影響,Transwell法檢測(cè)IP10對(duì)肝癌細(xì)胞株SK-hep1遷移、侵襲的影響。(4)采用CCK8檢測(cè)IP10對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC增殖的影響,流式法檢測(cè)IP10對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC周期的影響,Transwell法檢測(cè)過(guò)表達(dá)IP10的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)T淋巴細(xì)胞的趨化作用。(5)構(gòu)建小鼠皮下肝癌模型,到腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到約8mm時(shí),瘤內(nèi)分別注射PBS、空載慢病毒、過(guò)表達(dá)IP10慢病毒。觀察腫瘤體積變化,及采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IP10、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子CD31、M1型巨噬細(xì)胞中的特異性表面抗原CD86、T細(xì)胞表面標(biāo)志物CD3的表達(dá)情況并采用流式檢測(cè)法進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)IP10的肝癌細(xì)胞株及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株,通過(guò)嘌呤霉素篩選后在熒光顯微鏡下觀察,細(xì)胞100%帶綠色熒光。(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western-blot檢測(cè)顯示SK-hep1-IP10及HUVEC-IP10細(xì)胞株中的IP10在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均較轉(zhuǎn)染空載慢病毒和野生株高,此外,IP10能分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基上清中。(3)CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IP10基因的過(guò)表達(dá)并不影響肝癌細(xì)胞株SK-hep1的增殖,細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示,過(guò)表達(dá)IP10的細(xì)胞株較轉(zhuǎn)染空載慢病毒的細(xì)胞株及野生株的同質(zhì)粘附能力增強(qiáng),而異質(zhì)粘附能力減弱,Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力,結(jié)果顯示IP10基因的過(guò)表達(dá)并不影響肝癌細(xì)胞株SK-hep1的遷移及侵襲。(4)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)IP10的人臍靜脈細(xì)胞株HUVEC的增殖能力較轉(zhuǎn)染空載慢病毒的細(xì)胞株及野生株的低,即IP10能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,細(xì)胞周期結(jié)果顯示細(xì)胞增長(zhǎng)抑制在S期,Transwell檢測(cè)T淋巴細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示培養(yǎng)SK-hep1-IP10細(xì)胞株的細(xì)胞上清液對(duì)T細(xì)胞的趨化較空載組及野生組的多,即IP10可趨化T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。(5)成功構(gòu)建小鼠肝癌模型,三組小鼠的腫瘤體積比較發(fā)現(xiàn),注射過(guò)表達(dá)IP10慢病毒組的小鼠皮下腫瘤體積逐漸減小。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,注射過(guò)表達(dá)IP10慢病毒組中,腫瘤組織中的IP10、CD3的表達(dá)較其余兩組增高,CD31較其余兩組降低,而CD86變化不明顯,流式檢測(cè)腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況,結(jié)果顯示注射過(guò)表達(dá)IP10慢病毒組中CD4~+淋巴細(xì)胞及CD8~+的淋巴細(xì)胞均較對(duì)照組高。結(jié)論:(1)IP10是一個(gè)分泌蛋白,在SK-hep1-IP10及HUVEC-IP10兩株細(xì)胞培養(yǎng)上清中均能檢測(cè)到。(2)IP10可影響肝癌細(xì)胞的粘附性,但對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等作用不明顯。(3)IP10可影響腫瘤微環(huán)境,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)淋巴細(xì)胞的趨化、抑制新生血管的生成。
【圖文】：

圖 1-1 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建對(duì)照慢病毒后 SK-hep1 細(xì)胞熒光下圖像(×100);B:轉(zhuǎn)染空載對(duì)照慢病毒后 SK-100);C:轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)慢病毒 LV-IP10 后 SK-hep1 細(xì)胞熒光下圖像(×100);D:轉(zhuǎn)染后 SK-hep1 細(xì)胞白光下圖像(×100)。Figuer 1-1 Construction of lentivirus-transfected cell linence image of SK-Hep1 cells transfected with lentivirus LV5 (×100); B: White lells transfected with lentivirus LV5(×100); C: Fluorescence image of SKwith overexpressing lentivirus LV-IP10(×100);D: White light image of SKith overexpressing lentivirus LV-IP10(×100).含濃度為 2.5μg/mL 的嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，，顯微鏡下可見(jiàn)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的明成功構(gòu)建細(xì)胞系。

1-2 1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)細(xì)胞中提取的總 RNA的總 RNA;2:SK-hep1-LV5 細(xì)胞株提取的總 RNAe quality of total RNA was detect by 1% agarose g-Hep1 cell line; 2: RNA extracted fromSK-Hep1-ne.提取的總 RNA 在 1%瓊脂糖凝膠中8S、18S、5S。其中 5S 條帶亮度最 18S 條帶亮度的兩倍。瓊脂糖凝膠電實(shí)驗(yàn)需要。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2684328